第四章 基因工程PPT.ppt

GE HBGU LAM ? genome(48502bp) ?噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。 3. ?DNA的复制 模型 （1） ?型复制 （2）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。 形成多联体?DAN分子。 这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。 （1）构建原理 4. ?噬菌体载体的构建 （2）构建过程 ① 在这个非必须区内制造限制酶切点 ② 引进某些突变表型，作为选择标记 ③ 突变某些基因，使它成为安全载体 ④ 删除?DNA必须区段上常用的限制酶切点 ?噬菌体DNA上本身有5个 EcoR I 和7 个Hind III切点！ 删除?噬菌体的非必需区，留出插入空间。 （3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型 ① 插入型载体（insertion vectors) 如 ?gt10、?gt11、?BV2、?NM540、?NM1590、?NM607 1）免疫功能失活型： 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。 EcoR I cI ?gt10 插入导致载体不能合成阻遏物，??载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的?载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。 选择标记: 如?NM1149载体的两个克隆位点（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因内部。 2）?-半乳糖苷酶失活型载体 在?基因组中引入了LacZ’序列。（其上含有一个EcoR I 克隆位点）。 感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。 LacZ’ EcoR I Charon16A 选择标记: ② 替换型载体（substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于?DNA的非必须区两端。 用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。 可置换区 MCS MCS 如： ? EMBL4、Charon40等。 1）? EMBL4 ? EMBL4的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。 以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。 左臂 可置换区 右臂 EcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Sal I Sal I ?EMBL4 2）Charon40 Charon40的可置换片断是由DNA短片重复构成，片断之间有Hae I 切点。 在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。 左臂 可置换区 右臂 MCS MCS Charon40 Hae I 可取代片断中如果包含LacZ’，可用Xgal显色作筛选标记。 （4）?载体的筛选标记 ② 插入型载体 根据插入所引起的表型突变。 ① 置换型载体 Viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends) λ phage Lytic phase (Replicate and release) Lysogenic phase (integrate into host genome) ?载体克隆策略 置换型载体 ? DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。 5. ?载体的体外包装 在试管中与?噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。 必须利用噬菌体外壳的作用！ （1）体外包装 Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII ± RF Nicked by gene 2 protein + ss-Rolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phagereleased from the cell. ① 插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降 ② 实际克隆能力小于1500bp。 虽无包装限制，并非无限包装！ 5. M13载体的缺点 6. 噬菌粒载体（phagemid vectors） 由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。 MCS 噬菌体ori 质粒ori Ampr lacZ’ lacI 约3000bp（比M13小） ② 克隆能力大 能插入10kb的外源DNA。 ③ 两种复制形式 ① 分子量小 （1）噬菌粒载体的特点 既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。