第八章 克隆基因的表达系统 2014PPT.ppt

第八章 克隆基因的表达;基因的表达:指遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的过程;一、影响外源基因表达的因素;启动子;增强子;终止子 Terminator;衰减子;3 翻译过程对表达的影响;4 表达系统对表达产物的影响;二、外源基因在原核细胞中的表达;(一)、原核生物基因表达的特点 ;原核表达系统的注意事项 ;(二)、原核生物基因表达的调控序列;1.原核生物启动子结构;启动子;乳糖启动子lac---来自大肠杆菌的乳糖操纵子 色氨酸启动子trp-来自大肠杆菌的色氨酸操纵子 PL和PR启动子 -?噬菌体中得到的一类启动子 比lac启动子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高. -10 区顺序:GATAAT, -35区顺序:TGACTA tac启动子 由trp 和 lac启动子人工构建的杂合启动子;2.Shine-Dalgarno（SD）序列;核糖体结合位点对外源基因表达的影响;(2) SD序列与起始密码子之间的序列的影响 SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍;(3) SD序列与起始密码子之间的距离的影响：SD序列与起始密码子之间的距离是影响mRNA转译成蛋白的主要因素之一。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处。在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低 ;3.终止子结构;;4.衰减子;原核生物的选择标记基因;(三)、几种常用的原核表达载体;1.非融合型表达载体 ;pKK223-3 载体;; 2.分泌型表达载体- pIN III系列;pIN III系列：pINIII comA1-3;分泌型表达载体----pINIII-ompA1;3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列 ;P;启动子：tac 操纵基因：lacO， 调节基因：lacI S-D序列， ori：pBR322 ori， S-D下游融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶） lacI--Ptac----lacO---S-D/ATG---GST---基因插入位点---TGA;;(五)、提高外源基因表达水平的策略;减轻宿主细胞的代谢负荷;提高表达产物的稳定性;;; 二、 外源基因在真核细胞中的表达 ;（一）、真核生物基因表达载体的组成特征;1原核DNA序列;2启动子;3 增强子;4 终止子;5 内含子;6 polY(A)加尾信号;7 选择标记基因??报告基因 是表达载体的重要组成元件，通常编码一种正常细胞中不存在的酶，对转化细胞的生长和分化不发生影响。 ;哺乳动物基因转移的选择标记;酵母细胞于转化子筛选的标记基因;植物常用选择基因;昆虫细胞; 起报告和识别作用，它的表达产物对受体细胞无毒性，可反映外源基因在受体细胞中的表达水平。 大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（β-D-glucuronidase，GUS）； 细菌和萤火虫的荧光素酶（luciferase）； 水母绿色荧光蛋白（GFP）基因（Green Fluorescent Protein） 其它;几种报道基因的作用原理;;（二）、真核表达的受体系统 ;酵母受体系统;植物受体系统;昆虫细胞受体系统;哺乳动物受体系统;（三）、优化外源基因在真核细胞中表达的策略;1. 转录水平的优化最经济，最有效的基因表达调控方式;2、翻译水平的优化;3、防止外源基因失活;