高左旋多巴合成活性的重组大肠杆菌培养条件优化_李华钟.docVIP

——————————————————————————————————————————————— 高左旋多巴合成活性的重组大肠杆菌培养条件优化_李华钟 第20卷第3期 　　2001年5月JournalVol.20,No.3无锡轻工大学学报 　May.,2001ofWuxiUniversityofLightIndustry 文章编号:1009-038X(2001)03-0265-05　 高左旋多巴合成活性的重组大肠杆菌培养条件优化 李华钟,　孙伟,　陈坚 (无锡轻工大学生物工程学院,江苏无锡214036) 摘　要:对重组大肠杆菌进行培养条件的研究,得到细胞合成L-DOPA最佳培养条件为:L-tyro-sine0.2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O0.1%、FeSO4·7H2O0.001%、ZnSO40.001%、磷酸吡哆醛0.005%、牛肉膏0.5%、蛋白胨2%、DL-Alanine0.1%、温度37℃、pH值7.0、培养时间16h、摇瓶转速150r/min. 关键词:高左旋多巴;大肠杆菌;优化 中图分类号:TQ92文献标识码:A OptimizationofCultureConditionsforRecombinantE.coli ContainingHighActivityofL-DOPASynthesis LIHua-zhong,　SUNWei,　CHENJian (SchoolofBiotechnology,WuxiUniversityofLightIndustry,Wuxi214036,China) Abstract:CultureconditionsforrecombinantE.colicontaininghightyrosinephenollyasewerestud-ied.Optimumconditionofenzymeformationwascellsculturedat37℃for16hoursinthemediumcontaining0.2%L-tyrosine,0.2%KH2PO4,0.1%MgSO4·7H2O,0.001%FeSO4·7H2O,0.001%ZnSO4·7H2O,0.005%pyridoxalphosphate,0.5%meatextract,2%polypeptone,and0.1%DL-Alanine.InitialpHandrotationratewere7.0and150r/minrespectively. Keywords:highL-DOPA;E.coli;optimization 　　L-DOPA是治疗帕金森综合症的有效药物.20 世纪60年代末,国外一些学者开始致力于微生物 酶法合成L-DOPA的研究.用来自Citrobacterfre- undii、Erwiniaherbicola、Escherichiaintermedia的 酪氨酸酚解酶生产L-DOPA是一种高效的微生物 方法,因为这些菌含有高水平的TPL酶活.酪氨 酸酚解酶(EC)是依赖于磷酸吡哆醛的多 功能酶,这种酶能够催化丙酮酸、邻苯二酚和氨形 成L-DOPA.20世纪90年代初有人从C.fre- undiiMT-10419[5]和E.intermediaFKU10N[6]中 　　收稿日期:2000-10-16;修订日期:2001-03-13.[2～4][1]克隆出编码TPL酶的基因并测定其核酸顺序.作者与日本富山大学的刘吉泉博士合作,从C.fre-undii中将编码TPL酶的基因片段克隆到E.coliJM109中,得到重组菌E.coliJM109(pTPL)并对此株菌的培养条件进行了研究.1　材料与方法1.1　菌株重组菌E.coliJM109(pTPL) 作者简介:李华钟(1959-),男,山东烟台人,工学硕士,副教授. 266无　锡　轻　工　大　学　学　报 　　第20卷1.2　种子培养条件 LB液体培养基+150μmol/L的Amp,37℃,150r/min,12h.1.3　细胞L-DOPA合成能力的测定[7] 酪氨酸酚解酶活性可通过测定L-DOPA的生成量来确定酶活性的大小.标准测定体系(10mL)含有120mg的邻苯二酚、100mg的丙酮酸、200mg的乙酸铵、20mg的亚硫酸钠、20mg的EDTA,用氨水调pH值至8.0,加入从10mL发酵液中得到的菌体,15℃条件下反应1～3h. 　　从图-1可知,L-DOPA的合成在1～3h范