甾醇生物合成中关键酶―环氧角鲨烯环化酶分子生物学研究.docVIP

甾醇生物合成中关键酶―环氧角鲨烯环化酶分子生物学研究 　　摘 要：植物体中环氧角鲨烯环化酶催化2，3－环氧角鲨烯形成一系列三萜烯，为甾醇和三萜化合物的生物合成提供前体，这一催化反应被认为是甾醇和三萜化合物生物合成分支形成的关键位点，综述了甾醇和三萜化合物生物合成中的关键酶――环氧角鲨烯环化酶(OSCs)家族的生物学功能，基因克隆与属性，酶的细胞定位与酶活的表达调控等分子生物学研究进展。 　　关键词：环氧角鲨烯环化酶(OSCs)；甾醇；三萜化合物 　　中图分类号：Q946．5 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847(2007)01―0010-06 　　 　　植物体中许多次生代谢物产生于乙酸、莽草酸及甲羟戊酸等少数前体，在甲羟戊酸为前体的异戊二烯代谢途径中，又分别以异戊烯焦磷酸、?牛儿苗基焦磷酸、法尼基焦磷酸、?牛儿苗、?牛儿苗基焦磷酸为底物，形成一系列次级代谢分支，两个法尼基焦磷酸缩合形成的三萜角鲨烯被转化成2，3环氧角鲨烯(os)，接下来进行的2，3环氧角鲨烯(OS)环化是三萜化合物和甾醇生物合成的关键性第一步反应，所以，在此形成的甾醇(类固醇)生成支路和五环三萜(烯)生成支路成为基础代谢和次生代谢的分支点(图1)。 　　 　　催化2，3环氧角鲨烯环化形成一系列中间产物的酶，在酶促生物化学研究和酶工业生产上都有重要意义，真核生物中，2，3氧化角鲨烯被环化形成两种不同的三萜化合物：非光合生物中(脊椎动物、真菌)由羊毛固醇合成酶(LS)催化形成羊毛固醇，光合生物中则由环阿屯醇合成酶(CS)催化形成环阿屯醇，两者都是甾醇的合成前体．另外，2，3氧化角鲨烯(OS)在高等植物中还可以环化形成其他结构、功能各异的三萜化合物：齐墩果烷、乌斯烷、羽扇豆烷、达玛烷、木栓烷(friedelane)等，在OSCs分离、纯化，基因的克隆及表达分析上取得的新进展，使人们对酶结构与2，3氧化角鲨烯环化机理有了更深入的了解。 　　 　　1 环氧角鲨烯环化酶(OSCs)家族 　　 　　1．1 甾醇生物合成中的OSCs 　　甾醇生物合成的前体羊毛固醇和环阿屯醇的形成起始于环氧角鲨烯椅-船-椅-船构象的排列，产生中间体C-20原甾醇阳离子，接着这一中间体进行骨架??组形成羊毛固醇框架或环阿屯醇框架(图1)，上述环化反应分别由羊毛固醇合成酶(LS)和环阿屯醇合成酶(CS)催化完成。 　　通常纯化足够量的OSCs来进行氨基酸序列分析或生产抗体是很困难的，植物中环阿屯醇合成酶不仅量很少，而且很难获得具有生物活性的溶解酶．另外，植物中环氧角鲨烯经环化后能产生除环阿屯醇外一种或多种化合物，实验中无法用粗匀浆液来作为单一酶活的研究，近年来，通过对环阿屯醇合成酶的克隆体进行异源表达为解决这一难题带来了希望，但后来的研究发现环阿屯醇在酵母中表达量很少，使得环阿屯醇合成酶基因很难通过互补突变体的方法进行克隆，而植物阿屯醇合成酶代谢突变体又不易获得，一种解决办法就是采用体外饲喂氚标记的氧化角鲨烯底物对酵母提取液中环阿屯醇酶活力进行检测，另一种方法是用接有组成型酵母启动子的植物cDNA文库转化突变体酵母(SMY1)，然后用TLC或HPLC分析环阿屯醇酶的活性，还可以通过合成类似物的方法来仔细研究它们的分子细节，哺乳动物和真菌中，羊毛甾醇合成酶较易获得，动物肝脏和面包酵母匀浆物中都含有丰富的的羊毛甾醇合成酶，可以直接用于酶促反应，而且其中只含有一种变位酶，酶促反应中的产物也是唯一的，因此研究较为深入。 　　随着人们对LS、CS酶序列了解的日益增多，发现这些氨基酸序列中存在极度保守的部分，酵母、人类、老鼠的羊毛固醇合成酶(LS)的cDNA序列就是根据这些保守序列设计简并引物，通过PCR克隆出来的，亚麻(P.sativum)中环阿屯醇合成酶(CS)cDNA的克隆也是如此，cDNA的功能可以通过在LS－缺陷型酵母中来表达确定。 　　 　　1．2 三萜生物合成中的OSCs 　　环氧角鲨烯通过椅-椅-椅-船式构象变化，则形成四环素达玛正离子中间体，在环氧角鲨烯达玛二烯醇合成酶催化下，该正离子生成达玛烷型三萜，四环素达玛正离子还可进一步转化形成羽扇豆正离子或齐墩果正离子，再由它们形成羽扇豆、β-香树素和α-香树素，之后被修饰成五环三萜，三萜合成酶怎样催化形成不同产物的机制还不甚了解。 　　乌斯烷型三萜和齐墩果烷型三萜是两种主要的三萜骨架形式，那么，β－香树素和α－香树素形成的机制就成为首要解决的问题，实际上，环化的差异主要出现在C-19oleanyl正离子阶段，β－香树素和α－香树素合成酶活性位点的保守氨基酸残基可能与C-19 oleanyl正离子形成有关，其中特异氨基酸残基可能决定该正离子的转移特征，β－香树素和口，香树素合成酶的克隆有助于