il37b基因修饰的骨髓间充质干细胞对dss诱导的肠炎缓解作用的研究-study on the alleviating effect of il37b gene modified bone marrow mesenchymal stem cells on dss - induced enteritis.docx

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期：2015 年 5 月 10 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 必威体育官网网址 ，在 年解密后适用本授权书。 本论文属于  不必威体育官网网址 √ 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医 天津医科大学博士学位论文 中文摘要 目的 白介素 37b（IL-37b）具有显著的免疫抑制功能，骨髓间充质干细胞（MSC） 对炎症性肠病具有缓解作用并且是理想的外源基因表达载体。本研究的目标是 观察 IL-37b 基因修饰的小鼠 MSC 对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的炎症性肠病小 鼠模型的缓解效果并探讨发挥作用的机制。 方法 实时荧光定量 PCR（RT-PCR）和免疫组化检测溃疡性结肠炎病人的病变 肠组织中 IL-37 基因的 mRNA 和蛋白表达情况。构建表达 IL-37b 基因的腺病毒 载体。C57BL/6 小鼠致密骨片中分离培养 MSC，流式细胞仪鉴定 MSC 表面标记 分子，油红 O 和 von Kossa 染色鉴定 MSC 成脂成骨分化潜能。携带 IL-37b 基 因的腺病毒转染 MSC 后 RT-PCR、western blot 和 ELISA 鉴定 IL-37b 在 MSC 中 的表达。C57BL/6 小鼠饮用 3% DSS 连续 8 天，制备炎症性肠病小鼠模型。在给 于 3% DSS 的第一天，将小鼠随机分为 MSC-IL37b 组(腹腔注射转染 IL-37b 基因 的 MSC)，MSC-eGFP 组（腹腔注射转染对照病毒的 MSC），MSC 组（腹腔注射 未转染病毒的 MSC）和 PBS 组（腹腔注射 PBS）。每日记录小鼠体重和大便情 况，第 10 天处死小鼠，取结肠，测量结肠长度，HE 评估结肠炎症严重程度； 取小鼠脾脏，流式细胞仪分析脾脏单个核细胞中髓系来源抑制性细胞（MDSCs， CD11b+Gr1+）和 CD4+T 细胞中调节性 T 细胞（Tregs, CD4+CD25+Foxp3+）比例， 细胞内因子染色（ICS）分析 CD4+和 CD8+T 细胞炎症因子表达情况。 结果 IL-37 基因在溃疡性结肠炎病人的病变组织中表达明显增高，且其蛋白表 达水平随炎症程度的增加而增加，提示其参与了整个疾病进展过程。培养至 P3 时超过 95%细胞表达典型的 MSC 表面标记分子，且能成功分化为成脂和成骨细 胞。IL-37b 基因修饰的 MSC 分泌性表达 IL-37b 蛋白（13.03 ± 1.023 ng/ml）。第 10 天处死小鼠，结果显示：MSC-IL37b 组的体重减少程度显著低于 PBS 组(85.74 ± 2.01% vs. 73.85 ± 2.18%, P＜0.05)，PBS 组与 MSC 组或 MSC-eGFP 组相比，体 重减少趋势更明显，但无统计学差异 (73.85 ± 2.18% vs. 80.36 ± 2.28% P=0.07; 73.85 ± 2.18% vs. 77.38 ± 2.21%, P=0.28)；MSC-IL37b 组(5.733±0.1706 cm)的平均 结肠长度显著高于 PBS 组(4.375±0.2287 cm, P0.001)、MSC 组(5.117±0.1078 cm, P0.05)和 MSC-eGFP 组 (4.967±0.1333 cm, P0.01)，MSC 组或 MSC-eGFP 组的 结肠长 度都 显著 高 于 PBS 组（P0.01, P0.05） ；病 变肠 组 织的炎 症评分 MSC-IL37b 组(2.9±0.2449) 显著低于 PBS 组(5±0.4, P0.01)、MSC 组(3.9±0.3317, I P0.05)和 MSC-eGFP 组(4.2±0.3742, P0.05)，MSC 组显著低于 PBS 组(P0.05)， MSC-eGFP 组有低于 PBS 组的趋势，但无统计学差异 (P=0.0639)；在第 10 天 实验结束时，MSC-IL37b 组、MSC 组和 MSC-eGFP 组无小鼠死亡，而