hsamir301a3p靶向调节smad4在喉鳞癌侵袭转移中的机制研究-mechanism of h samir 301a3 p targeting smad 4 in the invasion and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma.docx

HYPERLINK \l _bookmark0 参考文献 102 HYPERLINK \l _bookmark1 综 述 109 HYPERLINK \l _bookmark2 致 谢 128 HYPERLINK \l _bookmark3 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果 131 HYPERLINK \l _bookmark4 个人简历 132 山西医科大学博士学位论文 山西医科大学博士学位论文 I I Hsa-miR-301a-3p 靶向调节 Smad4 在喉鳞癌 侵袭转移中的机制研究 中文摘要 研究目的 1. 从喉鳞状细胞癌差异性 microRNA 表达谱中筛选相关的 miRNA 进行研究； 2. 利用生物信息学方法预测 hsa-miR-301a-3p 靶基因并对靶向调控关系加以验证； 3. 研究 hsa-miR-301a-3p 和靶基因 Smad4 在喉鳞癌/癌旁正常黏膜新鲜标本、石蜡标 本和细胞株中的表达情况及相关性，结合临床病理参数评价它们的临床意义及与预 后的关系； 4. 研究 hsa-miR-301a-3p 和 Smad4 对喉鳞癌细胞增殖、克隆、迁移、侵袭、凋亡和 细胞周期的影响，明确它们的生物学功能； 5. 研究 hsa-miR-301a-3p 和 Smad4 参与喉鳞癌上皮间质转化的分子生物学机制。 研究方法 1. 结合文献资料，从课题组已获得的喉鳞癌差异性 microRNA 表达谱中获取相关的 miRNA； 2. 结合生物信息学方法预测 miRNA 的靶基因，利用双荧光素酶报告基因检测的方 法验证它们的靶向调控关系； 3. 利用 qRT-PCR 和免疫组织化学方法在喉鳞癌/癌旁正常黏膜新鲜标本、石蜡标本 和细胞株中的观察 hsa-miR-301a-3p 和靶基因 Smad4 表达情况； 4. 将 hsa-miR-301a-3p 和 Smad4 表达情况与临床病理参数、术后随访资料相结合， 评价它们的临床意义及与预后的关系； 5. 采用功能获得和功能缺失的实验方法将构建 Smad4 过表达载体和商品化的 hsa-miR-301a-3p 抑制物转染至喉鳞癌细胞，通过 MTS 法、EdU 法、平板克隆形成 实验、Transwell 法、流式细胞术等技术手段，观察它们对喉鳞癌细胞生物学功能的 II II 影响； 6. 采用 western blot 方法观察 hsa-miR-301a-3p 和 Smad4 对上皮间质转化过程中关 键分子的作用； 7. 采用 SPSS 20.0 软件进行数据整理，运用多种统计学方法对实验结果进行分析。 研究结果 1. 从 microRNA 表达谱中筛选出上调表达的 hsa-miR-301a-3p 作为研究对象； 2. 利用生物信息学方法预测出 Smad4 为 hsa-miR-301a-3p 的靶基因，成功构建 Smad4 的野生型和突变型 3’-UTR，双荧光素酶报告基因检测结果证实它们确实存 在靶向调控关系； 3. 在喉鳞癌/癌旁正常黏膜新鲜标本、石蜡标本和细胞株中，hsa-miR-301a-3p 表达 量增高，Smad4 表达量降低； 4. Hsa-miR-301a-3p 表达与喉鳞癌患者的 T 分期相关，Smad4 表达与喉鳞癌患者的 分化程度、颈淋巴结转移相关； 5. Hsa-miR-301a-3p 与 Smad4 两者之间呈负相关性； 6. Hsa-miR-301a-3p 低表达或 Smad4 高表达的喉鳞癌患者预后较好，Smad4 低表达 伴 hsa-miR-301a-3p 高表达的喉鳞癌患者预后不良； 7. 抑制 hsa-miR-301a-3p 表达或恢复 Smad4 表达可显著抑制喉鳞癌细胞的增殖、克 隆、迁移和侵袭能力，促进细胞凋亡，阻滞细胞于 G0/G1 期； 8. Hsa-miR-301a-3p 和 Smad4 的表达失调可引起上皮间质转化过程中重要分子变化。 研究结论 1. 喉鳞状细胞癌中存在差异性 microRNA 表达谱； 2. Smad4 是 hsa-miR-301a-3p 的靶基因，hsa-miR-301a-3p 对 Smad4 存在靶向调控作 用； 3. Hsa-miR-301a-3p 在喉鳞癌中表达上调，起到癌基因作用，对于喉鳞癌细胞增殖、 克隆、迁移和侵袭有促进作用，对细胞凋亡有抑制作用，转染其抑制剂后可将细胞 周期阻滞于 G0/G1 期； 4. Smad4 在喉鳞癌中表达下调，起到抑癌基因作用，对于喉鳞癌细胞增殖、克隆、 迁移和侵袭有抑制作用，对细胞凋亡有促进作用，可将细胞周期阻滞于 G0/G1 期； PAGE PAGE IV 5. Hsa-miR-301a-3p 高表达同时伴