hsamirna125a下调sirt6抑制膀胱癌进展的机制-mechanism of hsa mirna 125a down-regulating sirt 6 in inhibiting bladder cancer progression.docx

万方数据 万方数据 目 录 学位论文原创性声明 2 目 录 3 中英文缩写对照表 4 中文摘要 5 Abstract 6 第一章 前言 7 第二章 资料与方法 10 2.1 主要试剂及器材 10 2.2 组织标本 12 2.3 细胞培养及转染 13 2.4 实时荧光定量 PCR 14 2.5 蛋白免疫印迹实验 16 2.6 MTT 比色法细胞增殖实验 18 2.7 细胞划痕实验 18 2.8 酶联免疫吸附实验测细胞凋亡19 2.9 hoechst 染色法测细胞凋亡 20 2.10 统计学分析 20 第三章 结果 21 3.1 hsa-miRNA-125a 和 SIRT6 在膀胱癌中的表达 21 3.2 hsa-miRNA-125a 对膀胱癌细胞功能的影响 23 3.3 SIRT6 对膀胱癌细胞功能的影响 27 3.4 hsa-miRNA-125a 下调 SIRT6 在膀胱癌细胞中的表达 30 3.5 结合靶点检测 31 3.6 拯救实验 32 第四章 讨论 36 第五章 结论 38 参考文献 39 致谢 41 附录 1：在读期间发表的论文 42 附录 2：文献综述 43 3 汕头 汕头大学医学院 2008 级临床医学硕士研究生学位论文 中英文缩写对照表 缩略词 英文名称 中文名称 cDNA complementary DNA 互补 DNA dNTP deoxy-ribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 DEPC Diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetr azolium bromide 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二 苯基四氮唑溴盐 OD Optical density 光密度 ORF Open Reading Frame 开放阅读编码框 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 PBS Phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲溶液 RT-qPCR Real-time quantitative PCR 实时荧光定量聚合酶链式反应 siRNA Small interfering RNA 小干扰 RNA SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠 4 PAGE 5 PAGE 5 万方数据 中文摘要 背景及目的 膀胱癌是一种发病率高、复发率高，易转移的泌尿系统恶性肿瘤，目 前膀胱癌的发病机制尚不清楚，可能与原癌基因的激活、抑癌基因的失活、染色体异常 以及内外环境共同作用有关。miRNA 是一种长度约 18-22nt 的单链小分子非编码 RNA，通 过与靶 mRNA 特异的碱基配对引起靶 mRNA 的降解或翻译抑制，在转录后水平调控基因表 达，从而调控细胞分化、生长、增殖、代谢和凋亡等。SIRT6 是 sirtuin 蛋白家族成员之 一，是 NAD+依赖的去乙酰化酶，在维持基因组和端粒的稳定、调控炎症反应、糖和脂类 代谢方面都发挥重要作用，同时对抗衰老起着重要的作用，与肿瘤发生发展存在密切联 系。本研究中，我们探索 hsa-miRNA-125a 下调 SIRT6 在膀胱癌中的表达发挥抑癌作用的 机制。 方法与结果 利用实时荧光定量 PCR 技术检测了 hsa-miRNA-125a 及 SIRT6 在膀胱 癌 组 织 及 细 胞 中 的 表 达 ， 与 配 对 的 癌 旁 正 常 组 织 或 正 常 尿 路 上 皮 细 胞 相 比 ， hsa-miRNA-125a 在膀胱尿路上皮癌组织及癌细胞系中表达下调，SIRT6 在膀胱尿路上皮 癌组织及癌细胞中表达上调 。采用基因功能增强或丧失的方法分别研究两者对膀胱癌细 胞生长的影响。转染 hsa-miRNA-125a mimic 可以降低膀胱癌细胞增殖效率，促进膀胱癌 细胞的凋亡，抑制膀胱癌细胞迁移,干扰 SIRT6 mRNA 得到与转染 hsa-miRNA-125a mimic 相似的结果。双荧光素酶报告基因检测证明两者存在结合靶点，最后，转染 SIRT6 开放 阅读编码框后，转染 hsa-miRNA-125a mimic 对膀胱癌细胞增殖、凋亡、迁移产生的改变 被部分逆转。 结论 hsa-miRNA-125a 在膀胱癌发生发展中起抑癌基因作用；SIRT6 在膀胱癌发生 发展中起促癌基因作用；hsa-miRNA-125a 通过下调 SIRT6 在膀胱癌中的表达，从而抑制 膀胱癌的发