hp联合胃癌抗原致敏dc抗胃癌免疫的实验分析-experimental analysis on anti-gastric cancer immunity of hp combined with gastric cancer antigen sensitized dc.docx

本文存在的问题及今后应深入开展的研究 ............................................................. 43参 考 文 献 ............................................................................................................... 44致 谢 ........................................................................................................................... 52综 述 ........................................................................................................................... 53Hp 联合胃癌抗原致敏 DC 抗胃癌免疫的实验研究摘要 目的：探讨幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）联合胃癌抗原对人外周血单核 细胞来源树突状细胞（monocyte derived dendritic cell，MoDC）成熟和抗肿瘤功 能的影响，并筛选 Hp 联合胃癌抗原致敏树突状细胞（dendritic cell，DC）的较 优刺激时间。方法: 利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，进一步通过贴壁法获得单核细胞，经 RPMI-1640 完全培养基、细 胞因子 rhGM-CSF（1000U/ml）和 rhIL-4(500U/ml)诱导培养 5 天后分化为未成熟 树突状细胞（immature dendritic cell，iDC），培养过程中每 3 天半量换液和补充 细胞因子 rhGM-CSF 和 rhIL-4。在培养第 5 天分 3 组，Hp 联合胃癌抗原致敏组（Hp+Ly-mDC 组）加入胃癌细胞 BGC823 裂解物 0.1mg/ml，4h 后再加入 Hp 全 菌超声裂解物 10μg/ml 和 rhTNF-α 50ng/ml；胃癌抗原致敏组（Ly-mDC 组）加入 胃癌细胞 BGC823 裂解物 0.1mg/ml，4h 后再加入 rhTNF-α 50ng/ml；空白对照组（iDC 组）未加胃癌抗原、Hp 及 rhTNF-α；分别诱导培养 8h、24h、48h 和 72h 收获成熟树突状细胞（mature dendritic cell，mDC）。然后用倒置相差显微镜观察 DC 形态；用流式细胞仪检测 DC 表面 CD83，CD86 和 HLA-DR 的表达；MTT 法检测混合淋巴细胞反应中 DC 刺激自体 T 细胞增殖能力；不同组 DC 诱导的 特异性 CTL 作为效应细胞，胃癌细胞 BGC823 作为靶细胞，用 LDH 释放法检测 特异性 CTL 的毒性杀伤作用；用 ELISA 方法检测细胞因子 IL-12、IFN-γ 的分泌 水平。结果：（1）观察 Ly-mDC 组和 Hp+Ly-mDC 组具有形态不规则和大量毛刺状突起 的典型 mDC 形态，两组形态变化无明显差异；（2）Hp+Ly-mDC 组 mDC 表面标 记分子 CD83、CD86 和 HLA-DR 平均表达百分率均高于 Ly-mDC 组和 iDC 组， 其中 CD83、CD86 的表达水平差异有统计学意义(p＜0.05)，HLA-DR 差异无统 计学意义(p＞0.05)，Hp+Ly-mDC 组和 Ly-mDC 组达到最高表达水平的刺激时间分别为 24h 和 48h；（3）当刺激时间为 24h，Hp+Ly-mDC 组 DC 刺激 T 细胞增殖能力达最大(SI=3.52±0.31)；（4）Hp+Ly-mDC 组特异性 CTL 对胃癌细胞的杀伤 率高于 Ly-mDC 组和 iDC 组(p＜0.01)，且刺激时间为 24h 的杀伤率(43.41±1.85)% 高于 48h(37.67±1.93)% (p＜0.05)；（5）Hp+Ly-mDC 组细胞因子 IL-12、IFN-γ 的 分泌 量 在 刺 激 时 间 为 24h 达最高水平 ，分别为（ 627.24±31.05 ） pg/ml ，（1313.56±48.41）pg/ml，显著高于 Ly-mDC 组(p＜0.01)。结论：Hp 全菌超声裂解物可促进 DC 的成熟和活化。Hp 联合胃癌抗原刺激 DC 抗原提呈和抗肿瘤功能显著优于胃癌抗原。Hp 联合胃癌抗原刺激 DC 成熟和活 化存在时间动力学变