hpv16型e7与emt之间关系的分析-analysis of the relationship between hpv 16 e7 and emt.docx

HPV16型E7与EMT之间关系的研究中文摘要【目的】将真核表达质粒psilencer2.1-U6-hyg-shE7和pcDNA3.1-E7分别导入宫颈癌细胞株SiHa、C33a，人为改变两种细胞株中HPV16型E7基因的表达，通过对照研究揭示E7基因表达的变化与EMT之间的关系。【方法】利用已构建的真核表达质粒psilencer2.1-U6-hyg-shE7与pcDNA3.1-E7，分别转染宫颈癌细胞株SiHa、C33a，然后用药物Hygromycin和G418在合适的浓度下筛选，获得能够稳定沉默或者稳定表达E7基因的细胞株SiHa-psilencer2.1-U6hygro、SiHa-psilencer2.1-U6hygro-shE7、C33a-pcDNA3.1（+）及C33a-pcDNA3.1（+）-E7；运用细胞划痕实验和transwell检测细胞系的迁移运动侵袭能力；利用Real-timePCR、Westernblot分别在RNA水平和蛋白水平检测E7基因表达变化与EMT指标之间的变化关系。【结果】细胞划痕实验的结果显示：在SiHa-Blank、SiHa-vector及SiHa-shE7这三类细胞中，相对于空白对照和阴性对照来说，E7基因表达被沉默了的SiHa-shE7迁移运动能力明显降低（P0.05），差异具有统计学意义；另外，在C33a-Blank、C33a-vector及C33a-E7这三类细胞中，相对于空白对照和阴性对照来说，高表达E7基因的C33a-E7迁移运动能力明显升高（P0.01），差异具有统计学意义。Transwell细胞体外侵袭实验发现，SiHa-Blank，SiHa-vector和SiHa-shE7的跨膜细胞数分别为99+3，92+5，70+4；C33a-Blank，C33a-vector和C33a-E7的跨膜细胞数分别为69+2，76+6，93+4。3.Real-timePCR检测各个基因在RNA水平的表达发现，实验组HPV16-E7、E-cadherin、Vimentin相对于空白对照组及阴性对照组来说，差异有极为显著的统计学意义，P0.001，另外，N-cadherin、FN的相对变化也有统计学意义，P0.05；C33a组细胞表达量变化：实验组HPV16-E7、N-cadherin、Vimentin相对于空白对照组及阴性对照组来说，差异有极为显著的统计学意义，P0.001，另外，E-cadherin、FN的相对变化也有统计学意义，P0.05；4.WesternBlot检测各个基因在蛋白水平的表达发现，SiHa-shE7与SiHa-Blank、SiHa-vector对比观察，HPV16-E7的沉默效应比较明显，同时可见其上皮性标志物E-cadherin表达上调，间质性标记物N-cadherin、Vimentin的表达量下调；C33a-Blank、C33a-vector中HPV16-E7的表达量很低，与C33a细胞株的特性一致（没有感染HPV的宫颈癌细胞株），同时可以观察到C33a-E7相对于C33a-blank、C33a-vector，上皮性标志物E-cadherin表达有明显的下降，间质性标记物N-cadherin的表达有显著的上调，但同样是间质性标记物的Vimentin表达量的变化不明显。【结论】在宫颈癌细胞系SiHa、C33a中，E7基因的高表达能够上调间质性标志物，下调上皮性标志物，从而促进上皮间质化过程。同样的，E7基因表达的沉默或缺失，可以引起上皮性标记物的上调，间质性标记物的下调，阻碍上皮间质化过程。【关键词】上皮间质转化；E7；宫颈癌细胞系；TheresearchofrelationshipbetweenE7ofHPV16typeandEMTAbstractObjectiveTheeukaryoticexpressionplasmidspsilencer2.1-U6-hyg-shE7andpcDNA3.1-E7weretransfectedintoSiHa,C33aCervicalcancercelllines.TheexpressionofE7ofHPV16typewaschanged.TherelationshipbetweenchangesinE7geneexpressionandEMTwasexpositedviacontrolstudy.MethodsThealreadyestablishedeukaryoticexpressionplasmidspsilencer2.1-U6-hyg-shE7andpcDNA3.1-E7weretransfectedintoSiHa,C33aCervicalcancercelllines.Celllines,namedSiHa-ps