林业生物技术 知识课件10.转基因植物及其应用.pptVIP

中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 * 1 2 植物基因工程载体及其构建 植物遗转化方法和技术 3 转化体的筛选与检测 4 应用基因工程改良植物性状 5 转基因植物的环境释放及生物安全性问题 思 考 讨 论 2、什么叫DNA克隆？cDNA克隆与基因组克隆有何不同？ 3、基因工程安全措施？ 1、农杆菌法构建转基因植物的原理？ 1、植物基因工程载体及其构建 1.1 植物基因工程载体种类 目的基因克隆载体。是由多拷贝的大肠杆菌（E.coli）小质粒为载体，其功能是保存和克隆目的基因。 中间克隆载体。是大肠杆菌质粒插入T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成，是构建中间表达载体的基础质粒。 中间表达载体。是含有植物特异启动子和转录终止子的中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。 卸甲载体。是解除武装Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化载体的受体质粒。 植物基因转化载体。是最后用于目的基因导入植物细胞的载体，又称为工程载体。 1.2 植物基因工程受体系统 1、植物基因工程载体及其构建 原生质体。外源DNA易导入、基因型一致、适合各种转化方法、遗传稳定性差、培养技术难度大。 愈伤组织。外源DNA易导入、适合各种转化方法、可继续扩繁、遗传稳定性差、嵌合体高。 种质系统。外源DNA易导入、可简化或缩短育种纯化过程、受季节限制。 胚状体。外源DNA易导入、变异小。 直接分化芽。变异小、操作简单周期短、有嵌合体。 1、植物基因工程载体及其构建 1.3 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 T-DNA区 细胞分类素 合成基因 冠瘿碱 代谢基因 Vir区 复制起始区 LB 冠瘿碱 合成基因 RB 生长素 合成基因 根癌农杆菌，含有Ti质粒， 能诱导被侵染的植物细胞 形成肿瘤，即诱发冠瘿碱 发根农杆菌，含有Ri质粒， 能诱导被侵染的植物细胞 产生毛发状根 在植物基因转化上应用最多的是根癌农杆菌Ti质粒 1、植物基因工程载体及其构建 1、植物基因工程载体及其构建 1、植物基因工程载体及其构建 植物细胞受伤 产生酚类物质 （乙酰丁香酮） 激活根癌农杆菌 受体virA 激活virG 激活诱导其他基因表达 T-DNA单链释放 T-DNA单链与VirD2结合 T-DNA进入染色体 信号传递 诱导表达 VirD1、 VirD2协助 在VirD2、 VirD4和VirB作用下 1、植物基因工程载体及其构建 1.5 Ti质粒的改造与载体构建 多克隆位点 双元载体 1、植物基因工程载体及其构建 1.5 植物遗传转化中常用的选择标记基因及报告基因 1.5 .1选择标记 磷酸新霉素转移酶基因（nptⅡ）。由它编码的产物氨基葡萄糖苷磷酸转移酶对某些氨基葡萄糖苷类抗生素如卡那霉素、庆大霉素等有抗性。 潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）。通过酶促磷酸化作用使潮霉素发生磷酸化而失活，因此在含潮霉素B的培养基中，含有该标记基因的植株能存活，不含则死亡。 其他选择标记。 1、植物基因工程载体及其构建 1.5 .2 报告基因 报告基因 Reporter gene，是编码一种易于检测蛋白质或酶的基因，通过它的瞬时及稳定表达来检测目的基因是否转化成功，起报告作用。 β-葡萄糖酸酶基因（gus），来自大肠杆菌，在一定条件下与其底物X-Glucuionic acid作用会使有GUS活性的细胞染成蓝色。 1、植物基因工程载体及其构建 绿色荧光蛋白基因（GFP），来自水母。但野生型GFP发光较弱，甚至在某些植物中不表达，为适应在植物研究中的应用，已有许多改造的gfp可满足研究的需要。 冠瘿碱合成酶基因。nos和ocs存在于农杆菌T-DNA上，因其启动子是真核型，在农杆菌中不表达， 故通过检测转化体中冠瘿碱的存在可确定外源基因的表达。 花青素合成有关的基因。 2、植物遗转化方法和技术 2.1 载体转化 植物受体材料 （植物细胞、组织、器官等） 含植物转化载体的农杆菌菌液 浸染（10-20min） 共培养（2-4h） 选择诱导分化 （培养基+选择压+抑菌剂，约4周） 多次筛选培养 生根培养 外源基因组织化学检测、 分子检测 转基因植株 田间试验、遗传分析、形状鉴定 根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化 2、植物遗转化方法和技术 2.2 直接转化 采用基因枪法获得转基因植物 2、植物遗转化方法和技术 PEG(聚乙二醇)法，细胞融合剂，是外源DNA形成可被植物原生质体主动吸收的DNA沉淀。 电激法，利用高压电脉冲作用，使原生质膜的结构改变并形成可逆性的开闭通道，从而使原生质体易吸收外源DNA。 显微注射转化法，利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞的细胞核或细胞质中。 其他转化方法，超声波、脂质体等 2、植物遗转化方法和技术 2.3 种质系统介导转化 借助植物自身的生