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Your company slogan LOGO 质粒构建/分子克隆/DNA重组 20世纪60年代末70年代初，限制性核酸内切酶和DNA连接酶等的发现，使DNA分子进行体外切割和连接成为可能 1973年，Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化，同时将非洲爪蟾含核糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆菌，转录出相应的mRNA。 回顾历史 经典克隆步骤 a.酶切 b.连接 d.筛选 c.转化 案例 克隆大肠杆菌lac基因到pRG载体中 目的基因 目的载体 lac BamHⅠ EcoR I 加入 BamHⅠ酶切位点 加入EcoR I酶切位点 连接 ↑ 酶切 ↑ 目的基因两侧加入酶切位点 pRG载体多克隆位点 第一步： 设计目的基因PCR引物 目的： 1）通过PCR方法扩增目的基因 2）在目的基因片断两端增加酶加位点 克隆案例过程 ? 1、选择酶切位点 ? 2、选择保护碱基 ? 3、终止密码子 template 0.5 10*buf 2.5 dNTP 2 Mg2+ 1 10uM F 0.5 10uM R 0.5 KOD 0.5 H2O 17.5 25 1. 94℃(1min) 2. 94℃ (5s) 3. 56℃(20s) 4. 68℃(20s) back to step 2 for 35 times 6. 68℃ (10min) 第二步：PCR目的基因 10* K Buffer : 5 载体或目的片段: 10 EcoR I : 1 BamHⅠ: 1 ddH2O: 33 37℃ 4h 第三步：双酶切载体和目的基因 50ul lac BamHⅠ Hind III Hind III BamHⅠ 第四步：回收效率验证及连接 Loading volume: 5ul T4 ligase连接体系 T4 10*buf : 1 T4 ligase: 1 载体: 2 目的片段 : 6 10 ul 第五步：转化 100ul DH5α + 10ul 连接产物 CaCl2法感受态制备要点 1.对数生长期 OD600=0.5 2. 冰上进行；悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂 第六步：验证（1） 双酶切 (Hind III, Xba I) 10*M buf : 2 template: 4 0.1%BSA: 2 Hind III : 0.4 Xba I : 0.4 ddH2O: 11.2 20ul 37℃ 3h pRG质粒912位和1206位分别为HindIII和XbaI酶切位点，理论上的pRG-lac的该两酶的酶切片段大小分别为5348bp和3467bp，单克隆9和12电泳结果与预计一致。 第六步：验证 (2) 测序比对 限制性内切酶分类 BsmB I 相关知识点 限制性内切酶的切割方式 同尾酶 许多不同的限制酶切割DNA产生的末端相同且对称。它们产生相同的粘性末端。 EcoR I G↓AATCC Mfe I C ↓ AATTC ApoI R ↓ AATTY 相关知识点 相关知识点 相关知识点 相关知识点 相关知识点 相关知识点 相关知识点 相关知识点 相关知识点 相关知识点 相关知识点 相关知识点 Your company slogan LOGO
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