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AMPK通过转录因子SP1影响下丘脑GT1-7神经元KiSS-1基因转录的机制研究摘要目的：1.研究转录因子SP1对下丘脑GT1-7神经细胞中KiSS-1基因启动子活性的影响。2.探讨AMPK对下丘脑GT1-7神经细胞中转录因子SP1转位的影响。方法：1.建立KiSS-1基因启动子报告基因体系，用Promega荧光素酶双报告基因检测系统检测SP1SiRNA及SP1抑制剂MithramycinA对GT1-7细胞KiSS-1基因启动子活性的影响。2.用AMPK激动剂AICAR、AMPK抑制剂CompoundC和AMPKα1-SiRNA干预GT1-7细胞后，分别提取细胞浆蛋白、核蛋白和总蛋白，用WesternBlot方法检测转录因子SP1蛋白表达的变化。3.用AICAR、CompoundC孵育细胞，用免疫荧光法来进一步证实Western Bl ot 的结果。结果：1. 用SP1SiRNA以及不同浓度的MithramycinA作用于下丘脑GT1-7细胞后，KiSS- 1基因的启动子活性被明显抑制。2.AICAR可以降低GT1-7细胞核蛋白中SP1的水平而相应的增加浆蛋白中SP1的水平，相反的，CompoundC和AMPKα1- SiRNA都能够增加GT1-7细胞核蛋白中SP1的水平而相应的降低浆蛋白中SP1的表达水平。无论是AICAR,还是CompoundC或AMPKα1-SiRNA都没有使GT1-7 细胞总蛋白中SP1 的含量发生显著性的改变。3. 免疫荧光的结果提示AICAR能抑制SP1向细胞核的转位，而CompoundC则能增加SP1向细胞核的转位，与我们Western Blot 的结果相符。结论：AMPK对KiSS-1基因表达的抑制作用可能是通过抑制转录因子SP1的转位而减弱了SP1 对Ki SS-1 基因启动子的激活作用而造成的。关键词：KiSS-1 AMPK SP1 转位AMPKinhibitsKiSS-1genetranscriptionandexpressionthroughtranscriptionalfactorSP1inthehypothalamicGT1-7neuronsAbstractObjective:The studywas to investigatethe effectoftranscriptionalfactorSP1on thepromoteractivityofKiSS-1geneinthehypothalamusGT1-7neurons,aswellastoexploretheroleofAMPKplayedinthetranslocationofSP1inthesecells.Methods:(1).WetransfectedGT1-7cellswiththe2-kbfull-lengthKiSS-1genepromoter(PGL3-KiSS-1promoter)linkedwithaluciferasereporter,thentreatedthemwithSP1SiRNAorMithramycinA,knownasapharmacologicalsuppressorofSP1, anddetectedtheluciferaseactivitybyDual-LuciferaseReporterAssaySystem.(2).WeincubatedGT1-7cellswithAICAR(anartificialactivatorofAMPK), CompoundC(asuppressorofAMPK)orAMPKα1-siRNA,anddeterminedthelevelsofSP1proteinfromnuclearfraction,cytoplasmicfractionandtotalcellextractsby WesternBlot.(3).WetreatedGT1-7cellswithAICARorCompoundC,andperformedtheimmunofluorescenceanalysistodirectlyvisualizetheeffectofAMPK onthesubcellularredistributionofSP1protein.Results:(1).SP1SiRNA orMithramycinA atdifferentconcentrationscoulddecreasethepromoteractivityofKiSS-1geneobviouslyinthehypothalamusGT1-7cells.(2).AICARdecreasedthenuclearfractionandincreasedthecytoplasmfra