本科基础实验血清中r球蛋白的分离与鉴定.pptVIP

* 血清清蛋白和γ- 球蛋白的分离与鉴定 台桂花 2010年11月 课程安排 第1周：血清清蛋白和γ-球蛋白的分离 1、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白 2、利用透析方法除盐 第2周：血清清蛋白和γ-球蛋白的鉴定 利用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定血清清蛋白和γ-球蛋白 第3周：血清清蛋白和γ-球蛋白的定量分析 1、利用紫外吸收法测定蛋白质含量 2、利用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 第1周：血清清蛋白和γ-球蛋白的分离 一、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白 二、利用透析方法除盐 （一）盐析实验原理 盐析是一种分离纯化方法。 蛋白质在水溶液中稳定的因素：（1）电荷（2）水化膜。 高浓度盐溶液在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷，使蛋白质凝聚、沉淀析出（即盐析）。 不同蛋白质在不同盐浓度下沉淀，从而达到分离目的。 一、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白 （二）用于盐析实验的盐： (HN4)2SO4最常用，此外NaCl、磷酸盐等也曾用于盐析。 （三）盐析实验中盐浓度的表示方法： (HN4)2SO4饱和度 例如，饱和(HN4)2SO4、50%饱和(HN4)2SO4、33%饱和(HN4)2SO4 注意，不是100ml中含50g或33g (HN4)2SO4，查附表可知具体含量。 一、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白 （四）盐析实验方法 （1）利用饱和(HN4)2SO4溶液 首先配制饱和(HN4)2SO4溶液， 将蛋白质溶液置于冰浴上，使之冷却。 在快速搅拌的情况下，逐滴滴加饱和(HN4)2SO4溶液至所需浓度。 离心，分别收集上清和沉淀。 一、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白 （四）盐析实验方法 （2）利用固体(HN4)2SO4 首先将固体(HN4)2SO4研磨成粉末，根据样品体积和附表称量出所需的(HN4)2SO4粉末。 将蛋白质溶液置于冰浴上，使之冷却。 在快速搅拌的情况下，用小勺加少量(HN4)2SO4粉末，溶解后再加少量(HN4)2SO4粉末，直至所需浓度。 离心，分别收集上清和沉淀。 一、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白 （四）盐析实验方法 （3）分步盐析方法：以分离血清中?、? 、γ-球蛋白和血清清蛋白为例。 一、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白 血清 加(HN4)2SO4 至33%，离心 33%上清 （含?、?-球蛋白和清蛋白） 33%沉淀 （含γ-球蛋白） 加(HN4)2SO4 至50%，离心 33-50%上清 （含血清清蛋白） 33-50%沉淀 （含?、?-球蛋白） （五）本实验内容：利用分步盐析方法从牛血清中分离血清清蛋白和γ-球蛋白，按讲义操作。 一、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白 血清 加(HN4)2SO4 至33%，离心 33%上清 （含?、?-球蛋白和清蛋白） 33%沉淀 （含γ-球蛋白） 加(HN4)2SO4 至50%，离心 50%上清 （含血清清蛋白） 50%沉淀 （含?、?-球蛋白） （六）盐析分离效果（结果）：下次实验利用电泳法检测。 （一）透析实验原理 透析是一种分离纯化方法， 利用小分子能自由通过半透膜，而大分子不能通过半透膜的性质将混合物中的大分子和小分子分开 二、利用透析方法除去蛋白质溶液中的盐 （二）透析实验所用器材 半透膜：一般制成袋状，称为透析袋；也有非袋状，例如透析盒等。 《截留分子量（MWCO）》：大于截留分子量的分子不能通过半透膜，因而留在透析袋内；小于截留分子量的分子能自由通过半透膜，因而能被除去。 每种透析袋都注明截留分子量，例如3500、7000、10000，300000等。 透析液：水或缓冲液，视情况而定。 二、利用透析方法除去蛋白质溶液中的盐 （二）透析实验方法 根据所要分离的混合物分子大小选择截留分子量适合的透析袋。 清洗透析袋（新袋要事先在沸水中煮5分钟），检查是否漏液。 将待透析样品加入透析袋，扎紧袋口。 将透析袋放入装有透析液的容器中。 每隔几小时换一次透析液，直至小分子全部除去为止。 二、利用透析方法除去蛋白质溶液中的盐 （三）本实验内容：利用透析方法除去盐析法所得的血清清蛋白和γ-球蛋白中的盐，即(NH4)2SO4，按讲义操作。 待分离物质的分子量为 血清清蛋白：67,000 Da γ-球蛋白: 150,000 Da (NH4)2SO4: 114 Da 可选择常用的、相对价廉的、MWCO为1万的透析袋、 二、利用透析方法除去蛋白质溶液中的盐 （四）透析实验结果： 二、利用透析方法除去蛋白质溶液中的盐 除盐结果 BaC