蛋白的分离纯化112.PPT

蛋白质的分离纯化 蛋白分离纯化的一般步骤和原理 细胞破碎方法的选择： 动物细胞比较容易破碎，通过一般的研磨器、匀浆器、捣碎机等可达到目的 细菌细胞壁较厚，破碎需要用超声波、细菌磨、溶菌酶、某些化学溶剂（如甲苯、去氧胆酸纳）或冻融等处理 植物细胞因与细菌一样具有细胞壁，所以它们的破壁方法与细菌的破壁方法类似。 蛋白的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含蛋白原料，使蛋白充分溶解到提取液中的过程。也称为蛋白的抽提。 蛋白提取时首先应根据蛋白的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般来说，相似相溶；酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 蛋白基本上都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些蛋白与脂质结合或含有比较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 四 常见的分离纯化方法 调整硫酸铵溶液饱和度计算表 2.1.3 其他常见的沉淀分离方法 几种主要沉淀方法比较 高速离心机的最大转速为（0.8～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在蛋白的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。 几种主要层析方法比较 五 蛋白的纯化方法的分类 (1)根据蛋白溶解度不同进行的纯化 ①盐析法 ②有机溶剂沉淀法 ③共沉淀 ④选择性沉淀 ⑤等电点沉淀法 (2)根据分子大小进行的纯化 ①凝胶过滤 ②超滤 ③超离心 (3)建立在电学解离性质进行的纯化 ①吸附层析 ②离子交换层析 ③疏水层析 ④反相层析 ⑤电泳分离 (4) 利用专一亲和作用进行的纯化 ①亲和层析 ②亲和电泳 ③融合蛋白亲和分离法 (5).根据稳定性差别建立的纯化方法 ①选择性热变性 ②选择性酸碱变性法 ③表面变性法 六 蛋白的组合分离纯化策略 七 蛋白的纯度检验方法 (1)超速离心法 (2)电泳 (3)SDS电泳 (4)等电聚焦 (5)N-末端分析 (6)免疫技术 八 蛋白的浓缩、干燥与结晶 作业 1 蛋白质分离纯化的基本路线是什么？ 2 常见的蛋白质分离纯化方法有哪几种？ 2.5、电泳分离 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为： 纸电泳 薄层电泳 薄膜电泳 凝胶电泳 自由电泳 等电聚焦电泳 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。 毛细管电泳 SDSseparates proteins by MW 制备式电泳通常以不含 SDS 的原态 disc进行，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。 本节 目录 Resolution（分辨率） Speed（速度） Capacity（容量） Recovery（回收率） 设计分离纯化工艺的基本要求 浓缩与干燥都是蛋白与溶剂（通常是水）分离的过程。在蛋白的分离纯化过程中是一个重要的环节。 离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于蛋白在高温条件下不稳定，容易变性失活，故蛋白液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使蛋白液在60℃以下进行浓缩。 在固体蛋白制剂的生产过程中，为了提高蛋白的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有： 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥 盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热变性沉淀法 离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析 等电聚集层析 分离纯化方法 沉淀法 层析法 电学法 电泳法 等电聚焦 膜分离技术 透析 超滤 离心法 * 制作：高政权 一 蛋白质的提取、分离纯化基本技术路线 细胞破碎 蛋白提取 蛋白分离纯化 蛋白浓缩 蛋白贮存 微生物、动物或植物细胞 发酵液或细胞培养液 蛋白处理 离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。 冷冻干燥、结晶等 特征参数研究、酶分子修饰、固定化 初分离和细分离 层析法 电泳法 超离心法 透析和超滤 盐析（硫酸铵盐析） 等点电沉淀 有机溶剂沉淀 离心 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ 材料选择