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第二章 色谱法应用基础2.3 高效液相色谱法 HPLC（High performance liquid chromatography） 1941年马丁(M atin) 和辛格(Synge) 预言小直径粒子和高压差在液相色谱中的必要性 1958年氨基酸分析仪(AAA ) 的发明 1964年凝胶渗透色谱(GPC) 仪的发明 1966～ 1968年第一批有关HPLC 论文的发表 1969年第三届国际色谱讨论会(拉斯韦加斯, 美国) 1971年《现代液相色谱实践》的出版, 第一批HPLC 短期培训班 1973年HPLC’73 (因特拉肯, 瑞士) 1975年生化分离(蛋白质) 1979年手性旋光分离 1980年系统方法的发展, 计算机在HPLC 中的应用 HPLC 组成结构示意图 溶剂贮器（1）中的流动相被泵（2）吸入，经〔3〕梯度控制器按一定的梯度进行混后然后输出，经（4）测其压力和流量，导入（5进样阀（器）经（6）保护柱、（7）分离柱后到（8）检测器检测，由（10）数据处理设备处理数据或（11）记录仪记录色谱图，（12）馏分收集器收集馏分，（13）为废液。 高效液相色谱仪可分为以下几个部分 1. 高压输液泵：（1）功能：驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统；（2）性能要求：流量稳定，耐高压（30－60Mpa），耐各种流动相：例如：有机溶剂、水和缓冲液；?（3）种类：往复泵和隔膜泵。 2. 色谱柱?（1）?功能：分离样品中的各个物质；?（2）?尺寸：10～30cm长，2～5mm的内壁抛光的不锈钢管柱；?（3）?填料粒度：5～10μm，高效微粒固定相； 3. 进样器?（1）功能：将待分析样品引入色谱系统；?（2）种类：①注射器，10Mpa以下，1～20μL微量注射器进样；②停流进样；③阀进样，常用、较?理想、体积可变，可固定；④自动进样器，有利于重复操作，实现自动化。 4. 检测器??（1）功能：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号；?（2）分类：???????? ①示差折光化学检测器?????????②紫外吸收检测器 ③紫外一可同分光光度检测器?????????④二极管阵列紫外检测器?????????⑤荧光检测器?????????⑥电化学检测器 5. 馏分收集器?（1）功能：如果所进行的色谱分离不是为了纯粹的色谱分析，而是为了做其它波谱鉴定，或获取少量试验样品的小型制备，馏分收集是必要的；?? （2）方法：①手工，少数几个馏分，手续麻烦，易出差错。②馏分收集器收集，比较理想，微机控制操作准确。6. 数据获取和处理系统　功能：把检测器检测到的信号显示出来。 液相色谱分离的原理 2.3.1 HPLC分离机理、分类及主要应用 2.3.2 HPLC的特点及适用范围 特点 高压 40MPa 高速 0.1~9.99mL/min 高柱效 5000~30000块/m 高灵敏 10-10g/mL 适用范围 高沸点、难汽化、难挥发的分子量较高、热敏性物质 固定相种类多 流动相：不同溶剂，不同比例调节（梯度），可分离大量精细化学品及中间体，并可回收分离制备纯组分。 2.3.3 HPLC的几种类型 1、液固吸附色谱 表面多孔型固定相（硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等） 表面具有活性中心，吸附被分离物，样品与溶剂在其表面产生竞争吸附。 流动相选择原则：与被分离物，相似相溶 用于分离非离子型的有机物 流动相的极性顺序 P29 水＞甲醇＞乙醇＞异丙醇＞乙腈＞乙酸乙酯＞丙酮＞二氯甲烷＞乙醚＞氯仿＞苯＞甲苯＞四氯化碳＞环己烷＞石油醚＞氟代烃 2、液液分配色谱 正相色谱 固定相（液）极性大于流动相，分离非极性有机物 反相色谱 固定相（液）极性小于流动相，分离极性有机物 键合C8、C18等，流动相为亲水溶剂 固定相 全多空型固定液 直径5～10μm，Waters，Dupont，Zorbax等 固定液（机械涂布） 正相液液分配色谱固定液：聚乙二醇、甘油、乙二醇、乙二胺和DMF等 反相液液分配色谱固定液：甲基硅酮、氰丙基硅酮、角鲨烷、正庚烷和聚烯烃等 固定液（化学键合） 稳定性好，不易流失，寿命长，选择性可调节 反相固定液（疏水基团）：C8、C18和苯基等 正相固定液（亲水基团）：氨丙基、氰乙基和醇等 离子交换基团：阴离子交换基团的氨基、季铵盐；阳离子交换基团的磺酸 3、离子对反相高效液相色谱 特点：吸附与分配，分离极性化合物 用于含-SO3H、-COOH等中间体，水溶性染料 优点：分离能力强，选择性好，速度快 离子对色谱原理 极性流动相+反离子试剂 分离试样离子与反离子试剂形成离子对 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离