选修-3-：第-3-章-第-2-节：体外受精及早期胚胎培养(正式).pptVIP

§3.2体外受精和早期胚胎培养 人工授精 (AI)也称为人工输精，是指通过人为的方法将动物（或人）的新鲜或冷冻精液输入到雌性动物（或人）的生殖道内，使之受孕，以代替自然交配过程。 人工授精技术在畜牧业上应用十分广泛。目前，全球的奶牛业几乎全部采用该技术进行人工授精，加速了奶牛的品种改良进程，同时极大地节省了饲养成本。因为采用自然交配方法，一头优质公牛一次只能使一头母畜受孕，而采用人工授精，一头公畜一次的排精量可以使数百头母畜受孕。 人工授精技术运用于珍稀、濒危动物的保护 哺乳动物首次体外受精产仔简况 1978年7月25日，世界上第一个试管婴儿路易斯· 布朗在英国出生。她是由Steptoe和Edwards利用体外受精技术创造出的第一个试管婴儿。 据1997年11月4日英国官方宣布，英国自1985～1995年间，诞生“试管婴儿”达2.2万名，成为治疗不育不孕症的重要手段之一。  （第一代试管婴儿） 三、体外受精技术过程 包括： 1、卵母细胞的采集 2、卵母细胞的体外成熟 3、精子体外获能 4、卵母细胞的体外受精 5、体外培养 6、胚胎移植 卵母细胞的来源主要有三条途径：体内成熟：经超排处理后手术采取成熟卵泡内的卵母细胞或从输卵管内回收刚刚排出的卵母细胞；体外成熟：采集卵巢上卵泡中未成熟的卵母细胞，经体外培养使之成熟；活体采卵：用超声波扫描观察体内卵泡发育状态，然后吸取一定大小的卵泡卵母细胞，体外培养使之成熟。 对家畜来说，实际应用中—般采用后两种方法。 三、体外受精技术过程 抽取卵巢表面的卵母细胞 从卵巢采集的未成熟卵母细胞 活体采卵技术是利用超声波技术 (B超) 通过子宫壁从活牛卵巢采集到牛卵母细胞。 活体采卵技术首先需要一台能产生清晰图像的超声波仪并配有一定功率的探头，传送声波频率一般为5.0～7.5 MHz。其次需要一个真空泵，通过离心管与采卵针及导管相连，可在离心管内产生负压。当采卵针穿刺进入卵泡时，负压作用就将卵母细胞和卵泡液吸入离心管内，然后从采集的液体内检出未成熟的卵母细胞。 抽取卵巢表面的卵母细胞 从卵巢采集的未成熟卵母细胞 成熟前（左）后（右）的卵母细胞 卵母细胞体外成熟用的培养液： 大都使用合成培养液，如TCM l99、Ham’s Fl0和Ham’s Fl2等，尤以使用TCM199较为广泛。使用这种培养液，牛、羊、猪等的卵母细胞体外成熟率可达到80%以上。在基础培养液中添加犊牛血清(FCS)、促性腺激素(hCG、PMSG或LH+FSH)等都能促进卵子的体外成熟，起到诱发卵丘细胞扩展，促进卵裂的作用。 三、体外受精技术过程 成熟前（左）后（右）的卵母细胞 用Percoll密度梯度分离精子 三、体外受精技术过程 三、体外受精技术过程 精子体外获能的主要途径： 早期人们采用体内获能方法，即精子从交配母畜的子宫中冲取，再与卵子受精 。以后主要采用高离子强度(高渗透压)处理法 、高pH值处理法 、钙离子载体(IA)法 、肝素处理法 、咖啡因处理法 以及添加牛卵泡液 (BFF)、猪卵泡液 (PFF)、子宫液、输卵管液等。 一般说来，凡能促使Ca2+进入精子顶体和使精子内部pH升高的刺激，均可诱发获能。现在普遍采用肝素处理法和离子载体法。 卵母细胞的体外受精 卵母细胞与精子的体外受精 受精卵的漩涡振荡 无卵丘细胞的受精卵 2、培养液 受精卵的体外培养 用培养液冲洗受精卵3次； 转移到微滴或4孔培养板中培养； 液体石蜡油覆盖； 受精后72小时检查分裂率； 培养7～8天后统计囊胚发育率。 2-细胞胚胎 16-细胞期胚胎 显微受精技术的研究历史 1976年，Uehara和Yanagimachi开创了哺乳动物显微受精，他们将仓鼠或人的精子通过显微操作注射到仓鼠卵母细胞的细胞质内，使精子核在卵胞质中染色体发生去凝缩形成了原核，并能完成早期胚胎发育。 1988年，Iritani等将兔精子通过ICSI注射到卵母细胞内实现了受精，移植后得到仔兔；Mann通过SUZI方法将小鼠精子注射卵母细胞透明带下获得成功。迄今，已在牛(Goto等，1990)、马(Squires等，1996)等动物上获得成功。 1990年， Fishel等和Lippi等分别通过SUZI和ICSI方法将人精子注射到卵母细胞的透明带下和胞质内，分别得到了双胎婴儿和一个男婴。（第二代试管婴儿） 在SUZI和ICSI技术基础上，由于人为选择精子进行体外受精，缺乏自然