PCR_技术及其应用.pptVIP

目 录 PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用 经典循环参数（500bp以内） PCR技术的基本过程(2) Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer 循环仪 94℃ 55 ℃ 72 ℃ Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer 72 ℃ 5～7 min 琼脂糖凝胶电泳 PCR技术的基本过程(3) 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 3 PCR反应条件 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 94℃ 30s 55 ℃ 45s 72 ℃ 1min 94℃ 5min ×30次 72℃ 7min 42℃ forever 1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型 高浓度引物 低浓度引物 2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 3）多重PCR（复合PCR） 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 1 2 3 4 1 2 3 4 DMD：人类肌营养不良基因 A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失 B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者 C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式 多重PCR检测DMD基因缺失 * * 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Polymerase: DNA聚合酶 基因组DNA 引物 DNA聚合酶 DNA片段体外扩增 PCR技术的创建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）） Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 Kary B. Mullis（1944－） 生物样品 DNA片段 基因诊断 基因治疗 基因工程产品 法医