分子生物学第十章 分子生物学技术6.pptVIP

第一节 核酸及蛋白质操作技术 DNA操作技术 RNA操作技术 蛋白质操作技术 DNA操作技术 DNA的分离 DNA的纯化 DNA的鉴定 DNA的扩增 及基因文库的构建 一、核酸的分离与纯化 核酸提取的主要步骤 来源：细胞（包括培养细胞）、病毒 温和裂解，溶解核酸，使核酸与蛋白（组蛋白）分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、DNA/RNA及其他大分子。 抑制RNase活性是提取RNA的关键 在实验中，严格控制内源性和外源性RNase的污染。 RNase可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 外源性RNase 存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。 各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。 RNA操作中的要求 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 常用的RNA酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。 2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合 物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 RNA的分离和纯化-TRIzol试剂法 原理： 首先用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，加入氯仿产生第二相，离心后，RNA存在于水相。 经异丙醇沉淀水相中的RNA可用于Northern杂交分析、RT-PCR等； 存在于有机相的DNA和蛋白质用乙醇和异丙醇连续沉淀而分别分离，得到的DNA大小约20Kb，适用于PCR的模板；回收的蛋白质主要用于免疫印迹分析。 4、 探针的标记 （二）DNA测序鉴定 通过对DNA测序，利用序列分析来确定该DNA分子是否为目标分子。 DNA序列测定的3种方法比较： Maxam-Gilbert化学裂解法  化学裂解（直读，Sanger双脱氧末端法也是直读法）法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。 某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以β-消除反应，在3’和5’位上断裂磷酸二酯键。使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。 化学裂解法测序的原理 1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 表 特异断裂4种脱氧核苷酸的方法 三、核酸的扩增 （一）DNA的体内扩增 质粒在宿主细胞内的复制 （二）DNA的体外扩增 PCR扩增（相应的PCR扩增技术） 引物设计的原则——可采用primier 5 or Oligo 6软件设计 ① 引物的长度 通常在15～30个核苷酸之间。引物越长，特异性越高，合成的成本也越高。常见的引物长度在20个碱基左右。 ②G/C含量 引物的G/C含量一般在 50％左右， G/C含量