基因工程-第二章1.pptVIP

将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。 琼脂糖浓度 相同大小的线状 DNA片断在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同. 琼脂糖浓度(%)　　　分离范围（kb） 0.3 　　 5-60 0.6 　 1-20 0.7 　　 0.8-10 0.9 　　 0.5-7 1.2 　　 0.4-6 1.5 　　 0.2-4 2.0 　　0.1-3 琼脂糖凝胶浓度与分离效率 上样 上样缓冲液 甘油可增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指示带（溴酚蓝），可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色，使加样操作更方便 琼脂糖凝胶电泳 电压1-5V/cm 电泳时间大约1小时 最前缘至胶全长3/4时停止 溴化乙锭( EB)染色 3 核酸的分子杂交 3.1 核酸分子杂交原理 变性 在某些理化因素的作 用下，核酸双链分子 碱基对的氢键断裂， 疏水作用被破坏，双 链螺旋或发夹结构被 拆开，有规则的空间 结构被破坏，形成单 链分子，称为核酸的 变性。 引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。 变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。 3.1 核酸分子杂交原理 复性 在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。 在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。 复性过程 第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链，这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基不能配对就会重新解离，一旦找到正确的互补区，则其局部双链形成核（成核反应），然后核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子。 影响复性的因素 单链核酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接影响单链分子碰撞的几率，浓度越高，复性越快。 核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形成配对的难度也大，复性也慢。 核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列的总长度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。 温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度是比Tm低25℃。 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。 核酸分子杂交技术是依据核酸分子碱基互补、变性和复性原理，用标记的已知序列的单链核酸片段(DNA或RNA)作为探针,与未知的核酸片段进行杂交, 形成异源性杂交分子，然后通过标记信号的检测，鉴定样本中是否存在与探针互补的靶序列DNA。 包括：DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。 预杂交 为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂前的这些处理过程称为预杂交。 常用于预杂交的封闭物 变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。 高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。 核酸探针 根据探针的核酸性质 1.D