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基因操作原理 及相关技术 gene manipulation 1 定义： 对目的基因进行体外重组，再将重组分子导入受体细胞，使这个基因在受体细胞中复制、转录、翻译表达的过程。 克隆（clone）：n,无性繁殖系及其后代。基因完全相同; v,指从同一祖先产生这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。 gene manipulation 过 程 1、目的基因的获取（PCR,gene library)； 2、载体(vector)的选择与构建(工具酶等）； 3、目的基因与载体连接，构建重组DNA分子； 4、重组DNA导入受体细胞，转化子筛选； 5、受体细胞中目的基因的功能表达。 重组DNA技术的意义 填平了生物界种属间不可逾越的鸿沟，打破了自然种的界限。 缩短了生物进化的时间， 使人们能够对生物进行定向改造。 基因和基因组 基因：含有特定遗传信息的核酸序列（通常是DNA序列），是遗传物质的最小功能单位。 一个基因应包含：编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列；为保证转录所必需的调控序列、5′非翻译序列、内含子以及3′非翻译序列等。 一、构建基因文库筛选目的基因 基因文库： 某生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，经筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合称…。 理想地包含着该物种的全部遗传信息。 基因组文库构建过程 ① 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取 ② 载体的制备； ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）； ④ 载体与外源片段的连接、转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的挑取和保存。 缺点：基因中包含内含子 核酸提取 DNA提取原理： 1、裂解细胞; 2、采用离子型表面活性剂使膜蛋白和核蛋白变性，游离DNA; 3、采用蛋白沉淀剂沉淀、除去变性蛋白质，DNA留在上清液中； 4、在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出。 核酸提取 新鲜组织DNA的提取： 　胃粘膜组织约0.2 g，将其剪碎，加入DNA提取液(Sucrose、20×SSC、10% SDS、500 mmol.L-1 EDTA)和蛋白酶K，置37℃水浴中振荡24h，用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提2次，加入醋酸钠，冷无水乙醇沉淀DNA，再加入TE缓冲液使DNA溶解。次日用RNA酶作用3～4h，重复抽提、沉淀DNA步骤，进一步纯化DNA。 SDS:（Sodium dodecyl sulfate),十二烷基磺酸钠，去污剂,使蛋白质变性。 核酸提取 外周血DNA的提取： 　采适量静脉血，加入细胞裂解液，离心弃上清，进一步溶解蛋白质后，置37℃水浴过夜，次日用酚/氯仿/异戊醇抽提2次，加3 mol.L-1醋酸钠及冷无水乙醇沉淀DNA，再用TE缓冲液溶解DNA，置-20℃冰箱储存备用。 核酸提取 纯化DNA： 离心管中加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液混匀，3000 rpm ，离心10 min，移上层液体至新离心管中，重复上步至除尽蛋白，加入3 mol.L-1醋酸钠及无水乙醇，DNA成絮状物，离心，用70%乙醇洗DNA 2次，空气干燥5 min，加入适当体积TE缓冲液，置4℃/ -20℃冰箱保存。 核酸提取 提取RNA的材料： RNA是基因转录产生，不同组织在不同时期有特定的基因表达，因此，提取RNA的材料取决于所分析基因表达的组织。 如要分析肝脏中表达的基因，以肝脏为材料， 要分析脑组织中表达的基因，以脑组织为材料。 基因在多种组织中表达的，应选择较容易获得且对个体损伤最小的材料。 核酸提取 RNA提取方法的原理： 要严格防止RNA酶的污染，所用的试剂和器皿都要经过去RNA酶处理。 常用的是异硫氰酸胍/酚法,RNA与胍盐形成可溶性复合物。 核 酸 提 取 主要步骤： 将新鲜或冷冻的组织块切碎，迅速加入异硫氰酸胍/酚溶液中匀浆，再加入1/10体积氯仿，剧烈混合，离心分离有机相和水相，收集含 RNA 的水相，再用异丙醇沉淀RNA。 细胞总RNA的提取 1 6孔板细胞，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。 加入该试剂，可保持 RNA 的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分。 2 将各孔内消化好的细胞裂解液吸到DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15秒。DEPC：焦碳酸二乙酯，RNA酶的强抑制剂 细胞总RNA的提取 3 室温静置2-3分