5.3 课题3 血红蛋白的提取和分离（共36张PPT）.ppt

复习2：分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。P54 复习1：DNA的提取和分离的原理是什么？ 利用DNA与细胞内其他物质在物理和化学性质方面的差异提取DNA，去除其他成分。 如：溶解性，对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白质的分离： 蛋白质各种特性的差异，如： 1.分子的性状和大小 2.所带电荷的性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子的亲和力 可以用来分离不用种类的蛋白质。 一、凝胶色谱法 1、概念：也称分配色谱法 是一种根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 一、凝胶色谱法 2、原理： 凝胶色谱法中所用到的凝胶为多糖类化合物构成的多孔球体，小球体的内部有许多贯穿的通道。 不同相对分子质量的蛋白质因此得以分离。 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢； 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快。 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲溶液（洗脱剂）， 促使蛋白质分子的差速流动。 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 二、缓冲溶液（洗脱剂） 由弱酸和相应的弱酸强碱盐构成，可以调节PH相对稳定的溶液。 能够抵抗外界的酸和碱对pH的影响，维持pH基本不变。（模拟生物体内的过程） 本课题使用的缓冲液： 磷酸缓冲液 1、概念： 如：H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等 2、作用： 利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 三、电泳 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰氨凝胶电泳 1、概念： 2、原理： 3、常见的种类： 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 三、电泳 测定蛋白质分子量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS） 原理： SDS能与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移速率完全取决于蛋白质分子大小。 1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定 四、蛋白质的分离 本课题我们以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离血红蛋白的方法。 血液由__________和_____________两部分组成，其中 ____________最多。在红细胞的组成中，除水以外，约 90%是____________ 。血红蛋白由4条肽链组成，包括 __________________和__________________构成的，其中每条肽 链环绕一个_______________基团，此基团可携带一分子 O2或一分子CO2。血红蛋白因含有____________而呈______ 。 介绍：血液组成成分 血浆 血细胞 红细胞 血红蛋白 2条α-肽链 2条β-肽链 亚铁血红素 本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白。 血红素 红色 1.样品处理 ①红细胞的洗涤 ②血红蛋白的释放 四、蛋白质的分离 1.样品处理 ①红细胞的洗涤 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 5倍体积生理盐水 红细胞 缓慢搅拌10min 1.样品处理 ①红细胞的洗涤 ：去除杂蛋白 低速短时离心：防止白细胞沉淀 缓慢搅拌：防止红细胞破裂 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 5倍体积生理盐水 红细胞 缓慢搅拌10min 1.样品处理 ①红细胞的洗涤 ：去除杂蛋白 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 1.样品处理 ①红细胞的洗涤 ②血红蛋白的释放 洗涤好的红细胞中加入蒸馏水和40%的甲苯后，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min，红细胞破裂，血红蛋白释放出来。 a.蒸馏水的作用是: b.加入甲苯的作用是: c.充分搅拌的目的是: 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 2.粗分离 ①分离血红蛋白溶液 ②透析 滤纸 过滤 脂类物质 混合液 高速离心 10min 离心管 烧杯 有机溶剂 血红蛋白 2.粗分离 ①分离血红蛋白溶液 ②透析 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL 1mL