分子荧光分光光度分析.ppt

分子荧光分光光度分析 第一章 荧光分析基本原理 第二章 荧光分光光度计 第三章 定性与定量分析 第一章 荧光分析基本原理 第一节 荧光产生与测量 第二节 荧光参数 第三节 荧光与分子结构的关系 第四节 影响荧光测量的因素 第一节 荧光产生与测量 一、分子能级 二、荧光产生 三、磷光产生 四、荧光测量 第一节 荧光产生与测量 一、分子能级 分子的结构比原子复杂，最简单的双原子分子，有配对电子形成化学键维系其结构，大多数分子有偶数个电子，每个轨道中的电子自旋相反，这种分子状态称为单线态。当分子价电子被激发后，电子自旋取向有两种。与低能级电子自旋方向相反，为单线态；与低能级电子自旋方向相同，为三线态(亦称三重态)。 单线态与三线态性质不同，单←→单线态跃迁几率大，激发态平均寿命10-8s。单←→三线态跃迁几率小，激发态平均寿命可达1s。 第一节 荧光产生与测量 二、荧光的产生 分子荧光是一种光致发光，与紫外吸收过程相反。 在室温下，大多数分子处在基态的最低振动能级，当吸收特征频率光(激发光)后，可以激发到第一、二电子激发态单线态的各个不同振动能 第一节 荧光产生与测量 分子荧光为单←→单线态跃迁，荧光寿命仅10-8s，激发光消失，荧光立即消失。 从荧光的产生可看出： ① 分子荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始，与荧光分子被激发到哪个能级无关，故荧光光谱形状与激发光波长无关。 ② 荧光发射之前经内转换损失一部分能量，荧光波长比激发光波长长。 第一节 荧光产生与测量 三、磷光的产生 根据洪特规则，在不同轨道上有两个自旋相同电子的分子能量(三形态)，低于同一轨道上有两个自旋相反电子的分子能量(单线态)。因此，在太阳的分子轨道上，处于三线态分子的能量低于单线态分子。但是，处于第一电子激发三线态的一个振动能级几乎与第一电子激发单线态最低振动能级的能量相同。这样，由第一电子激发单线态的最低振动能级，有可能通过系间跨越，跃迁至第一电子激发三线态，再经振动弛豫跃迁至最低振动能级，由此激发态跃迁至基态便产生磷光。 第一节 荧光产生与测量 从磷光的产生可知： ① 磷光产生经过系间跨越(自旋禁阻)，发光速率较慢，激发光消失，磷光还能持续一定的时间，磷光寿命10-4～10s。 ② 系间跨越损失部分能量，磷光波长比荧光波长长，比激发光波长更长。 第一节 荧光产生与测量 四、荧光测量 由于荧光是一种光致发光，激发光从一个方向射入，荧光向四方八方辐射。所以，荧光可以与照射光束呈90o方向测量荧光。 与紫外分光光度法比 较，荧光检测背景黑暗， 荧光强度F直接反映荧光 物质吸收激发光的强弱。 而紫外吸光度大小是通过 透射光强I与入射光强I0比 较得到的。 第一节 荧光产生与测量 从荧光测量方式可看出： ① 物质紫外吸收系数一定，激发光越强，荧光发射越强，即F∝I0。 ② 分子荧光强度与测量仪器有关，提高荧光检测灵敏度，可通过改善仪器性能，比较变态物质的荧光发射强度，需要对仪器进行校正。 ③ 荧光分析提高灵敏度途径多，干扰因素也多。 第一章 荧光分析基本原理 从荧光产生与测量可知： ① 物质分子吸收光是产生荧光的必要条件； ② 磷光波长大于荧光波长，而二者的波长都大于激发光波长，磷光寿命长于荧光。 ③ 分子荧光强度F与吸光系数成正比，与激发光强度成正比。 ④ 荧光强度检测与仪器单色器光损失、狭缝宽度、检测器灵敏度有关。 ⑤ 大多数荧光物质只有一个荧光谱带，而吸收光谱有多个谱带。 第三节 荧光参数 一、激发光谱 二、荧光发射光谱 三、荧光量子产率 四、荧光强度与总荧光量 第三节 荧光参数 一、激发光谱 荧光物质的激发光谱(Ex)是激发辐射在不同波长处照射荧光分子，引起应发射的相对效率。或者，不同激发光(扫描入射光波长)激发荧光分子发射某一波长荧光(固定发射光波长)的相对强度关系图。 荧光物质吸收激发光愈多，处于激发态的分子愈多，荧光发射愈强。 Ex反映了物质对激发光吸收的状况， Ex的形状与吸收光谱极为相似，与所选荧光波长无关，荧光波长影响Ex大小。 直接扫描