基础医学论文心肌缺血对大鼠孤束核利钠肽受体表达的影响.docxVIP

基础医学论文心肌缺血对大鼠孤束核利钠肽受体表达的影响来源：医学论文发表---丁香新医学/利钠肽主要通过激活NPR.A(natriureticpep-tidereceptorsA)或NPR-B(natriureticpeptiderecep-torsB)受体，完成利尿、降压、调节神经、促进骨骼发育等功能，特别在调控心肾功能以维持机体稳态过程中起重要作用。另一种受体NPR-C(na-triureticpeptidereceptorsC)，被认为是可以从循环中清除利钠肽的受体。利钠肽受体广泛分布于中枢神经系统中，特别在下丘脑、脑干及室周器官有密集表达，在中枢调控心血管稳态过程中亦起着重要的作用心。孤束核是接受并整合心血管传人冲动的初级中枢，其内的胆碱能和儿茶酚胺能神经元参与了血压调节。现已知孤束核内存在有NPR-A和NPR-C阳性神经元，但这些神经元是否为胆碱能或儿茶酚胺能神经元?在心肌缺血后，孤束核区域的NPR.A、NPR-C的表达量是否随之发生变化?这些均未见报道。本研究拟通过检测NPR-A和NPR-C的表达变化和NPR.A/TH(或NPR-C/TH)、NPR-A/ChAT(或NPR-C/ChAT)的双标记情况，来探讨心肌缺血后利钠肽在孤束核内的部分作用机制。1材料与方法1.1材料和试剂清洁级3月龄雄性sD大鼠(体质量280-330g，河北医科大学实验动物中心提供，合格证编号：1006015)63只。兔抗NPR.A多克隆抗体和兔抗NPR.C多克隆抗体(Abcom)、山羊抗ChAT单克隆抗体(Millpore公司)、小鼠抗TH单克隆抗体(Sigma公司)、山羊抗小鼠IgG-FITC和兔抗山羊IgG.FITC(均中杉金桥有限公司)。1.2实验分组及模型复制大鼠随机分为免疫荧光化学组(3只)，实验组(模型组，43只)，实验对照组(假手术组，sham，8只)、对照组(control，9只)。免疫荧光化学反应组大鼠经4％多聚甲醛灌流固定，取脑组织行冰冻切片，免疫化学荧光反应。给实验组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，复制心肌缺血动物模型。大鼠手术后进行恢复性饲养。将成活的实验组大鼠随机分为3d取材组(9只)，术后7d取材组(7只)，术后14d取材组(9只)，术后18d取材组(9只)和术后28d取材组(9只)。实验对照组大鼠除了不结扎冠状动脉左前降支外，其他手术与实验组的处理相同。对照组大鼠不做手术处理，正常饲养。1.3TTC染色从实验组、假手术组和对照组取材过程中摘下的心脏的心尖部注入lmL3％伊万氏蓝。数秒后将心脏在4℃0.9％氯化钠注射液中冲洗，滤纸吸干水后一20℃保存30min。随后把冷冻后的心脏沿房室沟轴横切成2.0~2.5mm厚的断面，用0.1％TYC0.9％氯化钠注射液溶液37℃孵育30min。正常组织被染成蓝色，缺血心肌组织被染成红色，梗死区不着色，以此判定心肌缺血模型是否复制成功。1.4蛋白质印迹实验脑组织取材实验组动物分别在手术后的第3、7、14、18和28天深度麻醉(80mg/kg)，剪开胸腔，暴露心脏，经升主动脉插管，先用100mL0.9％氯化钠注射液冲洗血液。血液冲洗干净后，迅速摘下心脏，用吸水纸吸干多余水分后称重；取整脑，在闩平面取孤束核组织(约0.015g)。将取下的脑组织置于低温环境(0~4℃)备用。实验对照组大鼠、对照组大鼠于实验组术后3d按上述方法进行取材处理。1.5免疫荧光化学反应所有切片均采用漂浮染色法：冰冻切片放入漂洗盒，PBS换洗3次，然后加入4％牛血清(含0.3％Triton的PBS稀释)室温封闭40min；PBS换洗3次，加入小鼠抗TH抗体(1：10000)/山羊抗ChAT(1：1000)、兔抗NPR.A抗体(1：600)/兔抗NPR-C(1：1600)(用含0.3％Triton的PBS稀释)混合液，振荡后4℃冰箱中孵育72h；取出后PBS换洗5次；加入山羊抗小鼠IgG-FITC(1：500，用含0.3％Triton的PBS稀释)、山羊抗兔IgG-TRITC(1：1000，用含0.3％Triton的PBS稀释)混合液，室温下振荡孵育4h；PBS换洗5次，切片裱于挂有3％明胶的载玻片上，置于阴凉处避光晾干后，甘油封片。于荧光显微镜下观察并照相，记录结果。1.6蛋白质印迹分析分别将实验组、实验对照组以及对照组大鼠取下的孤束核组织进行处理。低温下加入RIPA裂解液研磨成浆液，离心后取上清液，考马斯亮蓝蛋白定量。按照蛋白标准曲线测定组织上清液中的蛋白含量，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(每加样孔中蛋白上样量60g)之后，将凝胶进行转膜，并进行NPR-A和NPR-C的印迹杂交(抗体稀释浓度为1：500)以内参肌动蛋白(B-actin)条带吸光度值作为标准，计算NPR-A和NPR.C蛋白的