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2.3 组织脱水、透明 脱水(Dehydration): 由于石蜡不溶于水，因而，组织经固定和水洗后含大量水分，需先用乙醇类试剂进行脱水。脱水是用一种既能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。如用浓度逐渐升高的酒精 (70-100%)将组织中的水完全置换出来。 现最常采用的脱水剂是乙醇，进行梯度脱水，此外， 丙酮、正丁醇、松脂醇等也可作为脱水剂。脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。 脱水的过程： 50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100% →100%乙醇 脱水应逐步进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。 注意事项： 1. 在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 2. 在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。 3. 如需过夜，应停留在70%酒精中。 4. 脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 透明（Clearing）: 脱水后，组织内含有大量的乙醇。由于石蜡不溶于水，也不溶于醇类试剂。因此，必须用一种既能与乙醇又能与包埋介质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最终的包埋创造一个有利的条件，该过程即透明。现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定 注意事项： 1.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。 2.更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 3.在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。 浸蜡（Infiltration）: 目的：除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。 方法：将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用液态石蜡完全置换出组织块中的透明剂，最后，组织细胞内被大量石蜡支撑，室温时石蜡凝固成固态，使组织能用于石蜡切片。 2.4 浸蜡 注意事项： 1. 尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度； 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低； 2. 操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。 3. 透蜡时间根据组织的薄厚、大小来进行。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。 ①水和酒精可以相溶。 ②酒精和二甲苯相溶。 ③二甲苯和石蜡可以相溶。 因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。 水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能相溶，所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下一个步骤将不能互溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成良好的切片。 我们可以看到： 2.5 包埋 将透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水中，使其立刻降温凝固成蜡块。 用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃。  操作过程：  包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。 常规石蜡包埋过程 (1)固定：10%福尔马林24h～48h，流水冲洗 (2)脱水：75％、85％乙醇，95％乙醇Ⅰ、Ⅱ，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。 (3)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ (4)浸蜡：二甲苯/石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ (5)石蜡包埋：修蜡块，标号 修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。 固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。 切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。 贴片：用小刀根据需要切成数段，分别用粘片剂贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。 2.6 切片 切片: 用切片机将组织切成5~10μm厚的蜡片，然后将其放到温水上，待其完全展开后，裱到有粘附剂的载玻片上。 切片前的准备工作 (1)载玻片的清洁：