组织培养相关技术3.ppt

凋亡细胞的生物化学特征 琼脂糖凝胶电泳法是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。用低浓度荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色。 凋亡细胞的染色质DNA发生断裂，大小为180-200bp的倍数。 从凋亡细胞中提的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可以观察到DNA条带呈现梯状(ladder)排列。 细胞凋亡时DNA呈现180bp片段 小片段DNA 4、诱导凋亡细胞的 免疫化学检测 使用抗组蛋白和抗DNA的单克隆抗体ELISA法检测凋亡细胞，不仅可以提高了检测的灵敏度，还可以在早期检测细胞凋亡。 （1）方法 抗组蛋白抗体包被酶标板，每孔加入包被缓冲液100μl，室温下包被1小时； 每孔加入细胞裂解缓冲液200μl，封闭缓冲液200μl，室温下封闭30min。 取指数生长期的细胞，用培养液稀释至105/ml。各取500μl(5×104个)细胞，加入4个Eppendorf管内。 加入含有凋亡诱导剂喜树碱1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml的培养液，置37℃、5%CO2孵箱中孵育4小时。 500r/min(或2000g)离心5min，去上清，加入1ml培养液再悬浮细胞，再离心，将细胞再悬浮于1ml细胞裂解液中，4℃作用30min。 在包被抗组蛋白抗体的酶标板上，于每孔加待测样品，室温下孵育90min。 洗板后，每孔加HRP-抗DNA抗体100μl，室温下90min。 洗板后，每孔加DAB-H2O2底物缓冲液100μl，室温下暗处反应10-20min。酶标检测仪波长405nm处测定各孔OD值。 （2）结果 凋亡细胞以富集系数（enrichmint factor,EF）表示，通常在指数生长期的培养细胞中有3%-8%的死细胞，凋亡死细胞会使OD值增加。 （五）流式细胞分选术 Flowcytometry 流式细胞仪 流式细胞仪(flow-cytometer,FCM) 对单个细胞及细胞中DNA、RNA、蛋白质理化性质进行快速测量的自动分析、分类收集的高技术。 利用这些信息，系统可以测定每个细胞的大小、密度，并依赖荧光染色测定DNA和蛋白质的含量。细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血液学、药物学等的研究。 目前，流式细胞术主要用于细胞的定性、定量研究。 流式细胞仪工作原理 标本单细胞悬液，经过荧光染料染色后，进入液流系统，细胞排成单行，通过高速流动的液流系统，经过检测区，被荧光染料染色的细胞经激光照射产生散射光信号和荧光信号，这些信号由光电倍增管接受，转换成脉冲信号，经过计算机分析整理后，形成细胞理化特征图，并进一步进行各种分析。 待检细胞 细胞悬液、培养细胞经分散处理后制备的细胞悬液、血液及骨髓。 流式细胞仪工作原理图 CD4和CD8 T 细胞分析 荧光探测装置 检测与分选 流式细胞仪数据分析（一） 流式细胞仪数据分析（二） 1、方 法 1．实体组织的单细胞样品 2．贴壁培养细胞 3．血细胞 4．悬浮培养的细胞体液中的细胞 5．骨髓细胞、脱落细胞 6．细胞的固定 一定浓度的甲醛、70%或95%乙醇，能用荧光染料进行染色，获得不同参数如细胞周期、细胞表面活性。 荧光染色 1．试管中加入1-2×108个细胞， 2．每管加入500μl适当稀释度的一抗溶液，混匀4℃反应30min 3．反复洗涤2-3次 4．每管加入500μl适当稀释度的FITC二抗，混匀。4℃反应30min，洗涤2-3次。 细胞分选 FCM能把研究所需要的细胞分选出来，通过激光束，细胞发出荧光被检测，按照要求分选，收集在合适的容器中。 FCM除可分选不同类型的细胞外，还能分选不同的细胞器。 （六）细胞酶活性测定 细胞化学技术(cell cytochemistry)是在保持细胞原有形态\结构基础上,利用已知的反应,原位显示细胞内某些化学成分,通过显微镜进行定位、定性、定量分析的方法。 分析的细胞形态、化学和功能的综合变化，对疾病的细胞损伤进行诊断、鉴别、分类及预后。 对于细胞化学技术的基本的要求： 保持细胞原有结构； 保持细胞内的原有化学成分和酶活性； 采用的方法可靠、可信，具有高度特异性； 反应形成的物质能在电镜和光镜下被观察到。 1、 酸性磷酸酶 酸性磷酸酶（acid phosphatase）是溶酶体的特征性酶，故常用此法对溶酶体进行研究。 酸性磷酸酶在酸性条件下分解β甘油磷酸钠，释放出的磷酸根与醋酸铅的醋酸根置换，形成磷酸铅，后者与硫化胺作用，最终形成棕黑色的硫化铅沉淀物，镜下清晰可辨。 10%甲醛固定标本。 2、琥珀酸脱氢酶 琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase)是线粒体的标志酶，参与细胞有氧呼吸，其活性与线粒体活性平行，在癌细胞中其活性常减弱。 琥珀酸脱氢酶使底物琥珀酸钠脱H+，无色的四氮唑蓝(nitroblu