组织化学相关技术5-免疫组化.pptVIP

第三章 免疫组织化学 前言 免疫组织化学（Immunohistochemistry） 又称免疫细胞化学。它 是组织化学的分支， 它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织 内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原 位检测技术。;1．发展简史 ——1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检 测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 —— 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁 蛋白标记Ab技术。 —— 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立 辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP ）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。;—— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC） 法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、 免疫电镜技术相继问世。 —— 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细 胞化学分类方法迅速发展。 ——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组 化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综 合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各 个学科，是目前生 命科学工作者应 该掌握的基 本技术之一。;2．免疫组织化学的技术分类 （1）根据染色方式分成：① 贴片染色 ② 漂浮染色 （2）根据Ag—Ab结合方式分成： ① 直接法 ② 间接法 ③ 多层法;（3）按标记物的性质分成： ① 免疫荧光技术（免疫荧光法） ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法） ③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法） 3．标记物 （1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一 般是不可见的，若在镜下检测，则必须 具有可视性标记物。;（2）常用标记物 ① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光 素（Fluorescein isothiocyanate ， FITC） —— 荧光显微镜下呈绿色荧光 四乙基罗达明（rho—damine RB200） ——荧光显微镜下发橙红色荧光 ② 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③ 生物素：（Biotin） ④ 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护 难一般不用）; 4．应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。;一、免疫组织化学技术;2．间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动 物的 IgG抗体）。※显色后镜检 特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原。;3．非标记Ab桥法： “桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体， 其二抗为未标记桥抗体。 （1）单桥法;;(2)双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次， 可增大染色强度。 ★ 特别提示：注意动物种属关系 4．PAP法（过氧化物酶—抗过氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法） ~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗 原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。;; 该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。 5．ABC法（亲和素—生物素—过氧化物酶复 合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex method，ABC法） Avidin： 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个 与生物素相结合的位点。 Biotin ： 生物素—维生素H，两者亲和力巨 大，牢不可破。;（1）ABC复合物的制备：;（2）ABC法反应原理;6．SP或