2分子克隆工具酶演示教学.ppt

第一篇　基因操作原理; ;第二章　分子克隆工具酶;Date;基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。 工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 ; 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己 DNA 的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。; ? 限制性内切酶 ? 甲基化酶 ? DNA连接酶 ? DNA聚合酶 ? RNA聚合酶 ? 磷酸激酶和磷酸酶 ? 核酸酶 ? 核酶 ;限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。;一、限制与修饰;噬菌体侵染细菌;噬菌体侵染细菌;　　细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统 (R-M Restriction-modification system)。 ; R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。细菌 R-M 系统的限制酶可以降解 DNA，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身 DNA，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。;限制性核酸内切酶(restriction endonuelease)　 　 是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。 ; ? 限制性内切酶的发现;限制性核酸内切酶（限制酶）： 　　在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。;EcoR I;限制性核酸内切酶的命名 属名　　　　种名　　　 ???名 Haemophilus 　influenzae d 嗜血流感杆菌d株 　　H i n d III　　　 H i n d III 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶;特性;二、限制性核酸内切酶识别的序列;在 DNA 分子双链的特异性识别序列部位，切割 DNA 分子，产生链的断裂。 2 个单链断裂部位在 DNA 分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA 片段，具有互补的单链延伸末端。;　　限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基 ;?6 个碱基识别位点： 　　 EcoRⅠ G↓AATTC?　 HindⅢ 　 ?A↓AGCTT ?7 个碱基识别位点： 　　　 BbvCⅠ ?CC↓TCAGC? 　　　 PpuMⅠ ?RG↓GWCCY ?8 个碱基识别位点： 　　　 NotⅠ GC↓GGCCGC ?　　　SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC;　　 当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。 ;II 型限制性核酸内切酶的基本特性 　　识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。;识别序列有连续的（如GATC）和间断的 (如 GANTC)两种，它们都呈回文结构。;　　DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点，用↓或／表示。 ;切割的位点：一般在识别序列内部，如G↓GATCC、AT↓CGAT、GTC↓GAC、CCGC↓GG、AGCGC↓T等。 　　少数在识别序列的两侧，如↓GATC、CATG↓、↓CCAGG等 ;EcoR Ⅰ;A A G C T T;三、限制酶产生的末端; 　若在 3‘-侧切割，则产生 3’ 突出粘性末端，如 PstⅠ： 5—CTGCAG－3 　Pstl 　 5—CTGCA- 3 　5—G－3 3－GACGTC- 5 　 　　　　 　3—G- 5 　十　3-ACGT－5