常用分子生物学技术课件精品.pptVIP

主要步骤： 蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移： 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应 （6）液相杂交 待测核酸分子与探针在杂交液中进行反应， 分离杂交双链和单链RNA，再进行检测。 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法 4. 探针的标记 探针的种类 标记物 探针标记方法 探针的纯化 探针的种类： cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针 标记物： 核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等 Target gene DNA denaturation Single colony Lysed Probe is labeled with radioactive 32P 探针标记方法： ①缺口平移法(nick translation) ②随机引物法(random primer) ③PCR标记法 ④末端标记法 探针的纯化： ①乙醇沉淀法 ②Sephadex G-50 柱层析法 ③微柱离心法 思考题 1.根据你的知识，谈谈分子生物学计数在新药研究中的应用。 2.什么是基因重组，其基本步骤包括哪些方面？ 3.PCR技术原理及主要步骤。 4. Southern blotting的原理及步骤。 (三) 分子杂交技术 1.基本原理 核酸分子杂交的基本原理：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。 2.常见杂交方式 (1) Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。 　(2) Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。 (3) Western 杂交：蛋白质分子检测 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因 此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。 3.分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交 固相杂交 (1)Southern blotting 1975年，英国Edwen Southern创建 检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析、基因诊断、分子克隆、法医学等 Southern bloting的主要步骤 1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)： 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测 核酸的分子杂交 将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。 杂 交 模 式 图 放射自显影 DNA印迹转移 探针杂交 － ＋ Southern Blotting的过程 1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交、杂交（放射性和荧光检测 5.结果检测 1.待测DNA样品的制备、酶切 DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释放，用TE液溶解，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质 标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。 步骤 分离目的序列与非目的序列 2.待测DNA 样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳 bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M 琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 电转印法