SOD酶的提取及测定.pptVIP

超氧化物歧化酶的提取、分离纯化与活力检测 内容： 细胞破碎及酶的抽提。 酶的柱层析分离操作。包括装柱，恒流泵及部分收集器的试调，上样，洗脱等。 酶的活力测定。 一.目的要求 　　 学习提取分离纯化超氧化物歧化酶的方法，掌握酶分离纯化的基本操作技术。包括以下内容： 　1．细胞破碎及酶的抽提； 　2．酶的柱层析分离操作； 　3．酶的活力测定。 二.基本原理 　　超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD, EC 1.15.1.1)是一 种歧化超氧负离子自由基O2─生成 H2O2和O2的金属蛋白，为胞内酶， 在生物体内具有延缓机体衰老，对肿瘤、自身免疫性疾病和辐射损伤具有重要的防御作用，是一种重要的药用酶。根据所含的金属离子，SOD可分为三类：Cu、Zn–SOD、Mn–SOD和Fe–SOD。SOD在生物界中分布极广，原核生物和真核生物中都有存在。 　　本实验从大豆种子中提取SOD，提取液经葡聚糖凝胶柱上层析，分离出SOD，然后用邻苯三酚法测定其酶活力。邻苯三酚在自氧化过程中产生有色中间物（红桔酚）和O2─,使溶液颜色变褐加深。加入SOD能歧化O2─阻止中间物（红桔酚）的积累，通过分光光度计比色分析反应液的颜色而测定其酶活力。 三．材料器具 材料：当年收获的大豆种子；Sephadex G―75凝胶。 仪器：高速组织捣碎机；高速冷冻离心机；层析柱（1×40cm）；自动部分收集器；恒流泵；进样器和微量进样器；可见/紫外分光光度计。 试剂：（1）pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液（内含1mmol/L EDTA）；（2）考马斯亮蓝溶液：称取100mg考马斯亮蓝G―250于50ml 95%乙醇中，摇动，待溶解后，加入100ml 85%磷酸，反复震动后加蒸馏水定容至1000ml,过滤待用；（3）pH8.2, 50mmol/L Tris-HCl缓冲液；（4）50mmol/L 邻苯三酚溶液；（5）10mmol/L HCl溶液 4. 试剂的配法 （1）pH8.2、50mmol/L?Tris-HCl  称取Tris?0.61g，EDTA-2Na?0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH?=8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。 （2）10mmol/L?HCl （3）50?mmol/L邻苯三酚 称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L?HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。 （4）SOD样液  四.实验操作 (一) SOD的提取 取当年大豆适量,冷水浸泡24h,沥干，加冰冻的pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液适量，用高速组织捣碎机捣碎。 用高速冷冻离心机以8000rpm离心除去固型物（需4—5次，每次15min）,上清液即SOD酶液。 （二）SOD的凝胶层析分离纯化 1.凝胶的准备： （1）?称取Sephadex G―75干凝胶2g，加适量洗脱液沸水浴溶胀2小时（也可室温溶胀24小时）。 （2）用倾斜法倾去表面悬浮的细小颗粒，室温储存于磷酸缓冲液中备用。 2．装柱： （1）将层析柱竖直固定于支架上,连接好恒流泵、部分收集器,调节洗脱液的操作压60cm。（2）先向层析柱中加入1/3高度的pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液,然后用大口进样器吸取上述准备好的凝胶徐徐注入柱中缓冲液内,让其自然沉降，沉降好的柱床顶部离管口1—2cm为宜。若高度不够，可放去部分缓冲液，搅起管中凝胶界面，继续添加凝胶。（3）装毕，用2—3个床体积的洗脱液洗脱，以使床柱稳定。 3．上样： （1）放去床表面上的缓冲液至与凝胶界面平齐。 （2）用进样器吸取酶液0.5ml，加样时将进样器尖端接触柱内壁并在离床表面数毫米处随加随沿内壁转动一周，使样品尽快分布于全表面。然后打开恒流泵，待样品液面与床柱表面平齐时，关闭恒流泵，以少许（0.1—1ml）缓冲液冲洗内壁数次，在打开恒流泵，放至液面与床柱表面平齐。 （3）先用进样器加1cm高度的缓冲液覆盖样品，然后加足缓冲液，连接好进液管。 4．洗脱： 开启部分收集器和恒流泵，以pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液进行洗脱。调节流速，控制每管收集洗脱液1ml，每管按收集顺序做好标记。 5．洗脱液酶蛋白含量的测定： ： （1）取洁净试管数支，分别加入考马斯亮蓝溶液3ml,摇匀，将其中一支试管不加任何试液作为对照管，其余的分别加入从第五收集管起的洗脱收集液50μl,反复摇匀。 （2）以对照管为调零液，用1cm比色杯在595nm波长下测定各管的OD595nm值。 （3）合并OD595nm值高的原收集液，此即纯化的SOD酶液。保留测酶活力。 （4）测定完毕，先用乙醇洗去比色杯的颜色，再用蒸馏水荡洗，