Western blot 实验技术及常见问题分析【精选-PPT】.pptVIP

转膜及抗体检测 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 * 转移到膜上的蛋白很少 蛋白分子量 10KD 蛋白的等电点 9 SDS浓度不合适 凝胶太厚 原因 对 策 蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 更换高pH值Buffer 在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率 延长转膜时间 * 背景太高 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高 原因 对 策 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 * 杂交信号很弱 抗体保存不当 抗原不充足 膜的漂洗过度 原因 对 策 抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测 增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照 减少漂洗的时间和次数 * 一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合 原因 对 策 制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点 设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合 出现非特异带 * 分子量Marker：确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的 内参：看家基因编码表达的蛋白 参照体系 * * Gg!BbWw7Rs2Mn)Ii$DdYy9Tt4Op+JkFfZAaVv6Qq1Lm(Gh!CcXx7Ss3Nn-Ij%EeYz9Uun)Hi$DdYy8Tt4Oo+JkFfZAaVv5Qq1Lm(Gh!CcWx7Ss3Nn-Ij%DeYz9Tu4Pp0Kk*Fg#AbVw6Rr1Mm)Hh$CdXy8St3Oo-JjEfZzaUv5Pq0Ll*Gg!BcWw7Rs2Mn)Ii%DdYy9Tt4Op+KkFf#AaVv6Qr1Lm(Hh!CcXx7Ss3No-Ij%EeYz9Uu5Pp0Kl*Fg#BbWw6Rr2Mm)Hi$CdXy8Tt3O8St3Oo+JjEfZzaUv5Qq0Ll(Gg!BcWx7Rs2Nn)Ii%DeYy9Tu4Op+KkFf#AbVv6Qr1Lm(Hh$CcXx8Ss3No-Jj%EeZz9Uu5Pq0Kl*Gg#BbWw6Rr2Mn)Hi$DdXy8Tt4Oo+JkEfZAaVv5Qq1Ll(Gh!CcWx7Ss2Nn-Ii%DeYz9Tu4Pp+Kk*Fg#AbVw6Qr1Mm)Hh$CdXx8St3Oo-JjWx7Rs2Nn-Ii%DeYy9Tu4Pp+Kk*Ff#AbVv6Qr1Mm(Hh$CcXx8St3No-Jj%EeZzaUu5Pq0Kl*Gg!BbWw7Rr2Mn)Hi$DdYy8Tt4Oo+JkFfZAaVv5Qq1Lm(Gh!CcWx7Ss3Nn-Ij%DeYz9Tu4Pp0Kk*Fg#AbVw6Rr1Mm)Hh$CdXy8St3Oo-JjEfZzaUv5Pq0Ll*Gg!BcWw7Rs2w7Rs2Mn)Ii$DdYy9Tt4Op+JkFf#AaVv6Qq1Lm(Hh!CcXx7Ss3Nn-Ij%EeYz9Uu4Pp0Kl*Fg#BbVw6Rr2Mm)Hi$CdXy8St3Oo+JjEfZzaUv5Qq0Ll(Gg!BcWx7Rs2Nn)Ii%DeYy9Tu4Op+KkFf#AbVv6Qr1Lm(Hh$CcXx8Ss3No-Jj%EeZz9Uu5Pq0Kl*Gg#BbWOp+KkFf#AaVv6Qr1Lm(Hh!CcXx8Ss3No-Ij%EeYz9Uu5Pp0Kl*Fg#BbWw6Rr2Mm)Hi$DdXy8Tt3Oo+JkEfZAaUv5Qq0Ll(Gh!BcWx7Rs2Nn-Ii%DeYy9Tu4Pp+Kk*Ff#AbVw6Qr1Mm(Hh$CcXx8St3NEeZzaUu5Pq0Ll*Gg!BbWw7Rs2Mn)Ii$DdYy8Tt4Op+JkFfZAaVv6Qq1Lm(Gh!CcXx7Ss3Nn-Ij%EeYz9Uu4Pp0Kk*Fg#BbVw6Rr1Mm)Hi$CdXy8SLm(Gh!CcWx7Ss2Nn-Ij%DeYz9Tu4Pp0Kk*Fg#AbVw6Rr1Mm)Hh$CdXy8St3Oo-JjEeZzaUv5Pq0Ll*Gg!BcWw7Rs2Mn)Ii%DdYy9Tt4Op+KkFf#AaVv6Qq1Lm(Hh!CcXx7Ss3No-Ij%EeYz9Uu5Pp0Kl*Fg#BbWw6Rr2Mm)