Western blot 实验技术及常见问题分析2896【共享精品-ppt】.pptVIP

转膜及抗体检测 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 * 转移到膜上的蛋白很少 蛋白分子量 10KD 蛋白的等电点 9 SDS浓度不合适 凝胶太厚 原因 对 策 蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 更换高pH值Buffer 在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率 延长转膜时间 * 背景太高 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高 原因 对 策 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 * 杂交信号很弱 抗体保存不当 抗原不充足 膜的漂洗过度 原因 对 策 抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测 增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照 减少漂洗的时间和次数 * 一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合 原因 对 策 制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点 设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合 出现非特异带 * 分子量Marker：确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的 内参：看家基因编码表达的蛋白 参照体系 * * 6$PCob)UHtg2ZMyl7RDqd+WIvi4!NAn9(TFse1YKxj6%PCob-UHug3ZMzl8REqd0WJvi5!OAna(TFsf1YLxk6%QCpb-VHuh3#Mzm8*RErd0WJwi5$OBna)TGsf2YLyk7%QDpc-VIuh4#Nzm9*SEre0XJwj5$PBoa)UGtf2ZLyl7QDqc+VIvh4#NAm9(SFre1XKwj6$PCob)UHtg2ZMyl7RDqd+WIvi4!NAn9(TFse1YKxj6%PCpb-UHug3ZMzl8REqd0WJvi5!OAna(TGsf1YLxk6%QCpb-VHuh3#Mzm8*RErd0XJwi5$OBna)TGsf2YLyk7%QDpc-VIuh4#Nzm9*SEre0XJwj5$PBoa)UGtf2ZLyl7QDqc+VIvh4!NAm9(SFre1XKwj6$PCob)UHtg2ZMyl8RDqd+WIvi4!NAn9(TFse1YKxj6%PCpb-UHug3ZMzl8REqd0WJvi5!OAna(TGsf1YLxk6%QCpc-VHuh3#Mzm8*RErd0XJwi5$OBna)TGtf2YLyk7%QDpc-VIuh4#Nzm9*SEre0XKwj5$PBoa)UGtf2ZLyl7QDqc+VIvh4!NAm9(SFre1XKwj6$PCob)UHtg2ZMyl8RDqd+WIvi4!OAn9(TFse1YKxj6%PCpb-UHug3ZMzl8*REqd0WJvi5!OAna(TGsf1YLxk6%QCpc-VHuh3#Mzm8*RErd0XJwi5$OBna)TGtf2YLyk7%QDpc+VIuh4#Nzm9*SEre0XKwj5$PBoa)UGtg2ZLyl7QDqc+VIvh4!NAm9(SFre1XKxj6$PCob)UHtg2ZMyl8RDqd+WIvi4!OAn9(TFse1YKxj6%PCpb-UHug3ZMzl8*REqd0WJvi5!OBna(TGsf1YLxk6%QCpc-VHuh3#Mzm8*SErd0XJwi5$OBna)TGtf2YLyk7%QDpc+VIuh4#Nzm9*SEre0XKwj5$PBoa)UGtg2ZLyl7QDqc+WIvh4!NAm9(SFre1XKxj6$PCob)UHtg3ZMyl8RDqd+WIvi4!OAn9(TFse1YKxk6%PCpb-UHug3ZMzl8*REqd0WJvi5!OBna(TGsf1YLxk7%QCpc-VHuh3#Mzm8*SErd0XJwi5$OBoa)TGtf2YLyk7%QDpc+VIuh4#Nzm9*SFre0XKwj5$PBoa)UGtg2ZLyl7QDqc+WIvh4!NAm6$PCob-UHtg3ZMyl8RDqd+WJvi4!OAn9(TFsf1YKxk6%PCpb-UHug3#Mzl8*REqd0WJwi5!OBna(TGsf1YLxk7%QCpc-VHuh3#Nzm8*SErd0XJwj5$OBoa)TGtf2YLyk7QDpc+VI