CD4单抗选择对于流式细胞术分析Th1／Th2极化的有效性评价.docVIP

CD4单抗选择对于流式细胞术分析Th1／Th2极化的有效性评价 《现代免疫学~2007年第27卷第5期 OD4单抗选择对于流式细胞术分析Th1/Th2极化的有效性评价 严茹红,张萍,朱雪明 (苏州大学附属第二医院检验科,苏州215004) 摘要:选择13B8.2和s3.5两株商品化的CD4单克隆抗体用于Fhl/Th2极化的流式细胞术评价,分析PMA,Ionomycin 和BFA单独或联合作用于外周血CD4抗原表达水平的变化,以确定Thl/Th2极化评价时有效的CD4设门单抗,并试图揭 示CD4抗原降调的机制.结果表明,13B8.2可作为CD4的设门单抗.PMA和Ionomycin联合刺激会导致外周血CD4抗原 的明显降低,而PMA单独刺激不能,且BFA与PMA和Iononmycin同时加入外周血中可部分抑制PMA和Ionomycin刺 激引起的CD4抗原内吞和降解. 关键词:流式细胞术(FCM);Thl/Th2极化;CD4抗原 中图分类号:R392.11文献标识码:A文章编号:1OO卜2478(2007)05—0368—05 Thl和Th2细胞是Th细胞(CD4T细胞)中 两个主要的效应细胞亚群,均由Th0细胞分化而 来,分别介导机体的细胞免疫和体液免疫应答.在 正常适应性免疫应答中,Thl与Th2细胞应处于 相对平衡状态.Thl与Th2细胞比例的失衡,即 Thl/Th2极化(分化)的异常或缺失,则导致感染 性疾病,过敏性疾病,自身免疫性疾病,流产,移 植免疫及恶性肿瘤等诸多疾病.Thl/Th2极化日 益成为临床和基础免疫学研究的热点. 对Thl和Th2细胞通常依据其所分泌的细胞 因子不同来鉴别,尚未确定人体Thl和Th2细胞 的表面标志.Thl细胞主要分泌II2,II.-12, IFN一丫和TNFB/a等,而Th2细胞主要分泌I 4,IL-5,II一6和II一10等.虽然EIISA(酶联免疫 吸附测定)法是检测可溶性细胞因子的主要方法, 但其只能反映总的细胞因子分泌量,不能确定分泌 特定细胞因子的细胞亚群,而流式细胞术能实现单 细胞水平的细胞因子检测,因此逐渐成为鉴别Thl 和Th2细胞亚群的重要手段.流式细胞术评价 Thl/Th2细胞极化时,需用PMA(佛波酯)和Ion— omycin(离子霉素)联合刺激PBMC(外周血单个核 细胞)或抗凝全血4～6h,同时必须加入BFA (brefeldinA)或Monensin(莫能菌素)等蛋白转运 抑制剂来阻断细胞因子合成后向细胞外的释放.然 收稿日期修回日期作者简介:严茹红(1979一),女,江苏苏州人,技师,主要从事生 化和免疫检验工作. 通讯作者:朱雪明(Tel:0512 而PMA刺激会引起T细胞膜表面CD4抗原的内 吞和降解_1j,致使流式细胞术检测Thl/Th2极化 时不能将CD4抗原用作Th细胞的表面标志.尽 管有学者采用CD3CD8细胞反设门,分选出 CD4细胞后再用PMA刺激等方法来规避PMA 对CD4抗原的影响,但由于这些方法不够准确或 操作较烦琐等原因而未被普遍采用.本文拟通过比 较两株商品化的CD4单抗,试图解决PMA刺激 引起的CD4抗原检测降调的问题,并初步探讨 CD4抗原表达降调的机制. 1材料与方法 11主要试剂与材料PMA,Ionomycin和BFA (美国Sigma公司);RPMI1640(美国GIBCO公 司);小鼠抗人CD3-TC(克隆号:S4.1),CD4一 FITC(克隆号:s3.5),IFN一7-PE(克隆号: B27),大鼠抗人II-4-PE(克隆号:MP4—25D2), Cal—Lyse溶血剂,Fixamp;Perm破膜剂,Mouse IgG1一PE和RatIgG1一PE(美国CaltagLaboratories 公司)分别作为小鼠抗人IFN一丫一PE和大鼠抗人IL厂 4PE的同型对照抗体.小鼠抗人CD4一FITC(克隆 号:13B8.2)购自西班牙Cytognos公司.血液来 源,本院健康体检者,男性,女性各半,年龄25 ～ 45岁,20例. 1.2主要仪器FACSCalibur流式细胞仪,配备 488nm氩离子和633nm氦氖双激光器,四个检测 通道,为美国BectonDickinson(BD)公司产品. 1.3外周血的刺激培养取肝素钠抗凝的外周 CD4单抗选择对于流式细胞术分析Thl/Th2极化的有效性评价 血,用RPMI16401:1稀释,分成若干管,PMA (25ng/m1),Ionomycin(1t~g/m1)和BFA(10g/ m1)单独或联合加入稀释的血液,37℃,5%CO 培养. 1.4细胞表型鉴定在指定时间取上述PMA, Ionomycin和BFA联合或单独