【教案】【人教版】选修一生物：5.3《血红蛋白的提取和分离》导学案.docVIP

专题5课题3 血红蛋白的提取和分离 一、基础知识 （一）凝胶色谱法 1、凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。 2、凝胶实际上是一些微小的 球体，这些小球体大多数是由 构成的，如葡聚糖或琼脂糖。 3、在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 （二）缓冲溶液 1、缓冲溶液的作用是 。 2、缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。 3、生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了 ，必须保持体外的pH与体内的 。 （三）电泳 1、电泳是指 。 2、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子 的差异以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。 3、两种常用的电泳方法是 和 ，在凝胶中加入SDS，电泳速率完全取决于 ，因此，在测定蛋白质分子量时通常使用 。 二、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。 （一）样品处理 1、红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时 分离红细胞，分离时采用 离心（500r/min），然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入 （质量分数为 ），缓慢搅拌 min， 离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。 2、血红蛋白的释放：在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。 3、分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心（2000r/min）后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透明液体，这是 ，第4层是 的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的 。 （二）粗分离：透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的 （PH7.0）中，透析12h。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的缓冲液。 （三）纯化：凝胶色谱操作 1、制作凝胶色谱柱 2、装填凝胶色谱柱 ①装填前将色谱柱 固定在支架上。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。 ②装填时凝胶要 缓慢倒入色谱柱内，装填时要轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填 ，色谱柱内不得有 存在，一旦发现，必须重装。 ③装填完后， 连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300mL物质的量浓度为20mmol/L的 （PH7.0）充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶 。 3、样品的加入和洗脱 ①准备：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的的缓冲液与凝胶面 ，关闭出口。 ②加样：用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意 。加样后打开下端出口，直到样品 后，关闭下端出口。 ③洗脱：小心加入物质的量的浓度为20mmol/L的 （PH7.0）到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待 接近色