实验二 荧光显微镜的基本使用方法.docxVIP

实验二 荧光显微镜的基本使用方法荧光显微术是在细胞或组织水平上对生物大分子进行定位和动态观察的最常用的实验方法。它广泛地应用于核酸、蛋白质、细胞器、细胞骨架、激素、离子等多种细胞结构或物质的定位和功能分析。很多生命科学的研究工作都需要频繁地使用荧光显微镜。比如，采用荧光探针的原位分子杂交用于确定某个基因在组织中的表达或在染色体上的定位（Polak et al. 1999; Andreeff and Wiley-Liss 1999），绿色荧光蛋白基因（gfp）用于了解某个基因产物在组织和细胞中的特异性分布（Chalfie et al. 1994; Haseloff and Amos 1995）等等。然而，在我们接触的一些低年级研究生中，一些同学并没有很好地掌握荧光显微镜的基本原理和使用方法。他们拍摄的荧光显微照片往往不能满足国际性高水平学术刊物的要求。这种状况既不利于科研效率的提高，也限制了研究成果的发表。因此，了解荧光显微术中的一些基本原理和注意事项、掌握荧光显微镜的基本使用方法是非常重要和有意义的。本实验讲解荧光显微镜的基本结构和使用方法。要求学生通过细胞核、细胞质DNA的荧光显微显示以及转绿色荧光蛋白基因拟南芥根、茎、叶细胞的观察掌握荧光显微术的基本原理和注意事项，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。实验目的：1. 了解荧光显微镜的基本结构； 2. 掌握荧光显微术的基本原理和注意事项；3. 掌握核酸的荧光显示技术，直观地认识细胞质DNA的存在；4. 了解绿色荧光蛋白（GFP）在蛋白质定位等研究中的应用，直观地认识GFP的荧光显微效果。实验内容：荧光显微镜的基本原理和结构荧光显微镜的放大成像原理与普通透射光显微镜完全相同。不同的是荧光显微镜需要另外的激发光光源和光路。因此，只要加上激发光光源和光路，再换上允许激发光通过的目镜（荧光显微镜的目镜在透镜玻璃的材质上与普通透射光显微镜不同），一台普通的透射光显微镜就可以被升级成一台荧光显微镜了。图2是本实验室使用的荧光显微镜的实物照片。与实验一使用的普通透射光显微镜相比，我们很容易找到荧光显微镜上多出来的部分。这些就是荧光显微镜的激发光光源和光路。图1是常用的落射式荧光显微镜的激发光光源和光路示意图。所谓落射式是指激发光自上而下穿过物镜，继而照射材料顶面的激发方式。这种激发方式可以得到较清晰的荧光图像。与之相对应的是透射式荧光显微镜。由于图像效果不如落射式，透射式荧光显微镜目前已很少使用。在荧光显微镜的光源和光路中，最重要的部分为汞灯（1）、激发光挡片、激发滤色镜和分色镜（见图1、2）。汞灯发出高亮度的全色光，是荧光显微镜的激发光光源。激发光挡片用于适时地切断激发光光路（如图1B），以减少样品的荧光淬灭。激发滤色镜是一些单色光滤镜，用于从汞灯的全色光中滤出激发样品所需要的单色光。在具体的实验研究中，样品往往需要用不同的荧光物质（染料）进行标记或染色，而不同的荧光物质可能需要不同波长的激发光。因此，使用荧光显微镜时需要根据样品上标记的荧光染料的激发要求更换激发滤色镜。一般的科研用荧光显微镜至少需要配备三套激发滤色镜，即紫外光、兰光和绿光激发滤色镜。分色镜是保证荧光显微成像质量的关键部件。它的特点是完全反射某个特定波段的激发光，而允许该波段以外的光，如样品上的荧光信号自由通过（如图1A）。分色镜的这种特性保证了只有样品荧光进入目镜光路。由于一种分色镜只反射特定波段的一种激发光，所以在荧光显微镜的使用过程中它也必须随着激发滤色镜的更换而更换。在一些厂家生产的荧光显微镜上，分色镜和激发滤色镜被做成了一个一体式的组件（如本实验使用的显微镜，见图2），以减少分别更换的麻烦。荧光显微术的基本原理和注意事项尽管荧光显微镜与普通透射光显微镜外观相近且共用同一套成像光路，但它们的实验用途完全不同。透射光显微镜用于观察细胞或组织的结构，而荧光显微镜则用于检测细胞或组织中特定的物质，如核酸、蛋白质等生物分子的存在和分布。因此，荧光显微术实际上是一种化学检测手段。它的原理是让细胞或组织中的特定分子带上荧光，我们通过观察荧光信号来确定这种分子的存在和分布。虽然荧光显微镜与普通透射光显微镜的分辨率是一样的（≤0.2μm），但由于荧光可以增强被标记分子的光学信号，加上荧光显微术的强反差特性，一些在透射光下无法观察到的分子组分，如由微管蛋白、肌动蛋白组成的细胞骨架等在荧光显微镜下就可以被清楚地显现出来。可见，利用荧光显微镜检测细胞内物质时，最首要的条件是要让被检测的组分“亮起来”。在个别种类的细胞中，一些特定的分子，如植物叶绿体中的叶绿素、花粉壁中的孢粉素等分子在常见的蓝色激发光下就可以发出持久、稳定的荧光。因此，检测这类分子只需要把细胞放到荧光显微镜下观察即可。这种除提供必要的激发光外不需要任何处理，物质自身可以直接发