细胞生物学常用技术1讲解材料.pptVIP

三、细胞培养技术 （Cell culture） 从活体组织中分离出特定的细胞，在一定的 条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以 至增殖的方法 in vitro 用培养细胞做实验 in vivo 用动物做实验 1.细胞培养的条件 (1) 固体表面：培养瓶、培养皿 (2)培养基 常见培养基：1640 DMEM (3)无菌 无菌操作：超净工作台、火焰消毒等 培养液中加入抗菌素 器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤） (4)其他 温度 37℃ 湿度 100% CO2浓度 5% 2.细胞培养的传代 原代培养:直接取材于有机体的细胞培养 取材 切割 消化 培养 传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中 取出，以1:2以上的比例扩大培养 原代培养 传代培养(保持分化特性) 传代 3.细胞系（Cell line） 在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁 殖能力，能够无限传代的细胞群。 变异细胞 细胞系 HeLa 人宫颈癌上皮细胞 3T3 小鼠成纤维细胞 无限繁殖 相差显微镜观察培养中的HeLa细胞 4.细胞融合（Cell fusion） （1）定义 在自然或人工条件下，使二个或二个以上 细胞合并形成一个细胞的过程。 异核体 杂交细胞 分裂 （二）电子显微镜技术 利用电子与固体样品作用时所发出的信息, 对样品进行微区观察和分析的技术 亚显微结构 超微结构 1.电子显微镜的特点 高分辨率 理论上 d = 0.002 nm 实际上 d = 0.1 nm 生物标本 d = 2 nm 高放大倍率 1,000,000 阴极 阳极 聚光镜（电磁透镜） 物镜 中间镜 投影镜 电镜照片 照相底片 真空、上下颠倒 2.透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM） (1)基本构造 (2) 超薄切片的制备 A 固定 戊二醛:蛋白质 锇酸: C=C (膜结构) B 脱水 上升梯度 乙醇：30% 50% 70% 80% 90% 95% 100% C 包埋 单体树脂加温聚合 D 切片 500 –700 ? E 重金属染色 U(醋酸双氧铀) Pb(柠檬酸铅) NADP酶反应 嗜锇反应 TPP酶反应 2.扫描电子显微镜 （Scanning electron microscopy, SEM） (1)原理 二次电子 (2)分辨率 3-10nm (3)样品的制备 A 固定 B 脱水 C 干燥 临界点干燥 D 染色 Au Pt 透射电镜 利用穿透标本的电子进行成像 (散射) 观察组织的二维切片 扫描电镜 利用标本表面发射的二次电子成像 观察组织的表面三维结构 （三）扫描探针显微镜 （Scanning probe microscope, SPM） 1.扫描隧道显微镜 使用原子尺度的探针在标本表面扫描，在探针针尖和样品之间施加一定电压，产生随标本表面形貌变化的隧道电流。 分辨率高 可在非真空状态下工作 直接观察大分子的三维结构 2.原子力显微镜 通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息。 样品无需具有导电性 可在三态下工作 活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测 二、细胞分离技术 （ cell separation） 从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法 1.制备单一细胞悬液