细胞生物学研究方法专题讲座讲解材料.ppt

第三章 细胞生物学研究方法;;;显微镜的发明打开了微观世界的大门;;; 1.显微镜的发明;2.光学显微镜构成： ①照明系统: ②光学放大系统: ③机械装置:镜座.镜柱等 ;经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。;4. 分辨力： D=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长；N．A＝ｎsin(α/2 )，为镜口率 , n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 ; ; 几种介质的折射率;不同光线的波长;光学显微镜的几个光学特点： 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；其中低倍镜0.28，高倍镜0.65，油镜1.25，油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm, 因此光学显微镜的最大设计倍数为1000X。;.普通光镜样品的制作:;紫外线发生装置(如弧光灯、水银灯等 );;;荧光显微镜的特殊用途: 用于观察能激发出荧光的结构 免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断 细胞与组织中物质的吸收与运输 化学物质的分布与定位等 荧光现象有两种: 自发荧光（叶绿素） 诱发荧光（加荧光素）; ;物镜与聚光镜同时聚焦到同一个小点。;;laser confocal scanning microscope, LCSM;;（四）暗视野显微镜 dark field microscope;;把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，明者更明，暗者更暗，立体感增强。从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜的特殊之处: 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ.光源聚光器中增加一环形光阑。 ;原理;用途：观察未经染色的标本和活细胞。;（六）微分干涉显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）;;;倒置显微镜;（八）当代显微镜的发展趋势;(九)荧光共振能量转移技术 ;什么是荧光 ?;*; 保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率;荧光能量共振转移的原理;;(十)荧光漂白恢复技术 ;光???色荧光恢复技术检测膜流动性;二、电子显微技术;透射电子显微镜;以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，小于0.1nm. 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。;电子显微镜与光学显微镜的基本区别;;电镜制样要求:样品很薄;样品的精细结构保持完好;莱卡超薄切片机 ;;2）负染技术;3）冰冻蚀刻 freeze-etching;;通过电视成像 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为: 0.2mm/10nm=20000X。;扫描电镜及其图像;工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 电视的方式成像 ;扫描电子显微镜原理;;人类红细胞;（三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM;扫描隧道显微镜原理;;STM image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu;三、显微操作技术micromanipulation technique;显微操作仪;;第二节 细胞分离技术;一、离心技术;（一）差速离心 Differential centrifugation;Low speed;（二）密度梯度离心;;;1、速度沉降 velocity sedimentation ;2.等密度沉降 isopycnic sedimentation;Velocity (A) and Eq