7第六章 转基因与作物育种教材课程.pptVIP

* 载体构建中常用的选择标记 如何选择和筛选转化体同样是一个重要问题。科学家家一直试图把转化体带上一个标记，从而便于选择和筛选。至今己建立了许多标记基因，并已插入各种转化载体中，作为一种标记基因。 * 必须具备以下四个条件： ①编码一种不存在于正常植物细胞中的酶； ②基因较小，可构成嵌合基因； ③能在转化体中得到充分表达； ④检测容易，并且能定量分析。 细菌筛选标记基因： 产物给予细胞产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。而转化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长等，从而将转化细胞选择出来，例如， Cat（氯霉抗性基因）。 植物筛选标记基因： 强调给转化细胞带上一种标记，起报告和识别作用，故称报告基因。 * 报告基因: Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因） 在植物细胞中所产生的葡糖苷酸酶在检测上具有以下特点： ①在一定条件下与X-G1ucuionic acid （5-bromo-4-chioro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid）底物发生作用，产生蓝色沉淀，既可以用分光光度计法测定，又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。 ②当加入4-甲基伞形酮基和葡萄糖苷酸时生成4-甲基伞形酮，发荧光（λ=465nm）。因而可以用荧光光谱法测定。由于荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。 ③检测容易、迅速并能定量，只需少量植物组织抽提液即可在短时间内测定完毕。 ④价格便宜。 * * GFP（绿色荧光蛋白基因）;LUC (萤火虫荧光素酶基因); 报告基因: * 启动子的选择 35S, cauliflower mosaic virus 35S promoter CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues. * (三〕受体材料的选择 受体是指用于接受外源DNA的转化材料。 良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 1、高效稳定的再生能力； 2、受体材料要有较高的遗传稳定性； 3、外植体来源方便，如胚和其它器官等； 4、对筛选剂敏感； 5、转化率高 * 常用的受体材料有以下几大类型: 1.愈伤组织再生系统 外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体 因此需要连续的再生系统 * 2.直接分化再生系统 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。 3.原生质体再生系统 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。 * 4.胚状体再生系统 是指具有胚胎性质的个体。 优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。 缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。 5.生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。 * （四）转基因方法 概括起来说主要有两类： 第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。 第二类是外源目的DNA的直接转化。 * 1.载体介导转移系统 最常见的转基因方法。 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcing?plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。 * 农杆菌共培养侵染 诱导愈伤组织 分化生芽 生根 叶盘转化法 (1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。 * (2)真空渗入法 将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。 简便、快速、可靠，不需要组织培养。 (3)愈伤组织共培养 (4)原生质体共培养 * 2.外源基因直接导入法 （1）化学刺激法 细胞融合剂：聚乙