[理学]生物化学课件 第四章 核酸杂交.pptVIP

一、探针(probe)的概念 一小段用染料(同位素、生物素或荧光)标记的(末端或全链)已知序列的多聚核苷酸，与固定在膜(NC、PVDF或尼龙）上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 简言之，探针指已知序列的标记核酸片段。 二、探针(probe)的种类 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 人工合成的寡核苷酸探针（ASO） 基因组探针：用基因克隆技术分离获得的特异的DNA序列。 RNA探针：特异DNA序列在体外转录出的RNA序列。 cDNA探针：以特异mRNA序列为模板，在逆转录酶催化下合成的cDNA序列。 寡核苷酸探针（ASO）：人工合成已知序列的寡核苷酸片段。 探针种类 三、探针的标记物 （一）放射性同位素标记物： 32P、 3H、 35S 生物素（biotin） 地高辛（digoxigenin ） 荧光素（ fluorescein ） 酶（碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶） （二）非放射性标记物： 四、探针的标记方法 酶标记法 化学标记法 体外标记方法： 切口平移法（nick translation) 随机引物法 （random priming） DNA的5’末端标记 PCR标记法 几种探针标记方法： 第三节 印迹杂交技术 印迹杂交技术以固相杂交为基础. 印迹杂交技术是将通过凝胶电泳分离的待测核酸转移并结合到固相支持物上，然后与探针进行杂交并分析。 印迹指将凝胶中的待测核酸转移到固相膜上。 一、固相支持物 硝酸纤维素膜 尼龙膜 活化滤纸 二、印迹方法 毛细管虹吸转移法 真空转移法 电转移法 三、印迹杂交过程 样品制备 电泳分离 预杂交 洗膜 分析 杂交 印迹 第四节 常用核酸分子杂交技术 DNA印迹法 RNA印迹法 斑点杂交法 原位杂交 主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。 一、 DNA印迹技术 (Southern blotting) 　1975年,Southern印迹杂交（Southern blot）由英国人埃德温·迈勒·萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）创建。 埃德温·迈勒·萨瑟恩 方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，通过显色，检测特定DNA分子的含量。 两个主要过程： 一是印迹（blotting） 二是分子杂交 主要步骤: RE酶切待测DNA 琼脂糖电泳分离待测DNA片段 使DNA变性 中和 预杂交 杂交 放射自显影 结果分析 一、 DNA印迹技术 (Southern blotting) DNA的纯化、酶切 凝胶电泳分离DNA片段 DNA变性 转膜、固定 预杂交、杂交 检测 分析 制备探针 Southern blotting 的步骤： DNA分子杂交实验 ① ② ③ 目 录 放射自显影照片 将RNA样品完全变性，通过琼脂糖凝胶电泳按分子大小分离，然后转移到固相膜上，固定后与探针进行杂交。 二 、RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。 Northern blotting 的步骤 制备探针 变性、凝胶电泳 泡胶，洗去变性剂 转膜、固定 预杂交、杂交 检测 分析 RNA的纯化 与DNA印迹的区别： DNA印迹是先电泳后变性、转移； RNA印迹是先变性后电泳、转移，且不能 采用碱变性 固定 直接将样品点在膜上 预杂交、杂交 检测 分析 制备探针 三、斑点杂交法(dot blotting) 特点: 简单,但特异性差. 在细胞保持基本形态的情况下将探针注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在载物片上的细胞内进行。 四、原位杂交法 (in situ hybridization) DNA点阵 本章重点: 掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应 掌握核酸杂交的基本原理 熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印迹/Northern印迹的步骤及用途 印迹杂交