实验三 Folin.docVIP

姓名：郭沈杰 年级专业：2012级生物科学 同组者：蔡萍萍 学号：12050011012 实验三 Folin-Wu法定量测定血糖的含量 一、实验目的 1、掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。 2、学会制备无蛋白血滤液。 3、掌握7200型可见分光光度计的使用方法 二、实验原理 葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基， Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）而沉淀。 Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+ （Cu2O） 无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应, Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物—钼蓝 。 Cu2O+酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物 OD420比色 血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。 三、实验仪器 1、25mL血糖管×3支； 2、血糖管橡胶塞×3个； 3、1mL胖肚吸管×1支； 4、100mL锥形瓶×2个； 5、漏斗架×1个； 6、普通漏斗×2个； 7、水浴锅×1个； 8、电炉×1个； 9、移液管 1mL×2支; 2mL×3支;5 mL×2支;10 mL×1支; 10、滤纸×1盒； 11、吸耳球×2个； 12、7200型分光光度计×1台; 13、表面皿×1个 四、实验试剂 1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） (1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。 (2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。 2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。 3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。 4、碱性硫酸铜溶液 A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml. B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。 5、酸性钼酸盐溶液： 称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。 置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。 6`待测样品：新鲜兔血1ml 五、实验步骤 1、无蛋白血滤液的制备： 用移液管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀。 再加0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕后充分摇匀，放置5～15分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴）。 用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。 2、血糖的定量测定： 取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入蒸馏水2ml（空白管）；第二支血糖管中加入标准葡萄糖液2ml；第三支血糖管中加入无蛋白血滤液2ml。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。 一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。 六、实验结果 全血中加入蒸馏水、钨酸钠和H2SO4后，沉淀慢慢由鲜红变为暗棕色。 在三支血糖管中加入新配制的碱性硫酸铜溶液后，溶液变为蓝色（从左到有依次为第一、二、三支血糖管）。 在沸水中煮八分钟后，溶液依次呈现不同的颜色（从左到右依次为第一、二、三支血糖管）。 冷却后，加入酸性钼酸盐溶液，再用蒸馏水稀释至25ml。从左到右蓝色依次 加深 试管样液 第一支试管 空白管 第二支试管 标准样液A0 第三支试管 待测样品A OD420 0.000 0.135 0.182 附原数据： 由下式得血糖含量： M=A/A0 x C0 ÷0.1×100 =0.182/0.135×0.1÷0.1×100 =134 mg/ml 七、实验分析 葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基， Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）而沉淀。