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化 验 作 业 指 导 书 新乡市众富生物饲料有限公司受控文件 编制人：李倩 审核人：尚同军 批准人：王善智 生效日期：2015年1月1日 粗蛋白测定作业指导书 测定方法 凯式定氮法 原理 凯式法测定试样中氮的含量，即在催化剂的作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物为硫酸铵，加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。 试剂 (1) 硫酸 化学纯 含量为98%，无氮 （2）混合催化剂 0.4g硫酸铜，6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀。1:15 （3）氢氧化钠 化学纯 40%水溶液 （m/v） （4）硼酸 化学纯 2%水溶液（m/v） （5）混合指示剂：0.1%甲基红乙醇溶液，0.5%溴甲酚绿乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期不得超过三个月。 （6）盐酸标准溶液 基准无水碳酸钠法标定 0.1mol/L盐酸标准溶液：8.3ml盐酸注入1000L蒸馏水中 0.02 mol/L盐酸标准溶液：1.67 ml盐酸注入1000L蒸馏水中 0.2N盐酸标准溶液：16.8ml盐酸注入1000L蒸馏水中 （7） 蔗糖 分析纯 （8） 硫酸铵 分析纯 干燥 4.仪器设备 （1）实验室用样品粉碎机或研体 （2）分样筛 孔径0.45mm（40目） （3）分析天平 感量 （4）消煮炉或电炉 （5）滴定管 酸式，10，25ml （6）凯式烧瓶 250 ml （7）凯式蒸馏转置 半微量水蒸汽蒸馏式 （8）锥形瓶 150 250 ml （9）容量瓶 100 ml （10）消煮管 250 ml （11）定氮仪 以凯式原理制造的各类型半自动，全自动蛋白测定仪。 5.试样的选取和制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。 6. 操作步骤 （1）试样消煮 称取试样0.5000---1.0000g，精确至0.0002，放入消化管中，加入6.4g混合催化剂，再加入12----15 ml浓硫酸，将消化管置于消化炉上消化，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力（360度---450度）。然后继续加热至少45min（消化时间视消化率而定，消化过程至少2h） （2） 试样制备 将试样消煮液冷却，冷却后用约50m水稀释摇匀 ，做为试样分解液 （3）试样蒸馏 采用半自动定氮仪时，将带消化液的管子固定在蒸馏托盘上，以25ml硼酸为吸收液，加入2滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入50ml 40%氢氧化钠进行蒸馏，蒸馏时间以吸收液体积达到100ml---150 ml时，降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。 （4）半微量蒸馏法 将试样消煮液冷却，加入20 ml蒸馏水，装入100ml容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液，将半微量的装置的冷凝管末端侵入装有20ml硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内，蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10ml注入蒸馏转置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口处加水密封，再加10ml氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，在蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。 （5） 滴定 蒸馏后的吸收液立即用盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色极为终点，同时按上述步骤做空白滴定。 （6）空白测定 称取蔗糖0.5g，代替试样，进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.2ml，消耗0.02mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.3ml， 7.分析结果的计算和表述 （V2-V1）C*0.0140*6.25 粗蛋白=-------------------------------------------*100 m 式中： V2--------滴定试样时所需标准盐酸溶液体积，ml V1------滴定空白所需标准盐酸溶液体积，ml C--------盐酸标准溶液浓度，mol/L m-------试样质量，g 0.0140-------每毫克当量氮的克数 6.25--------氮换算成蛋白质的平均系数 0.02 mol/L盐酸标准溶液的标定方法 称取0.02—0.03g（视标液的浓度而定）于270---300度灼烧至恒重的基准无水碳酸钠，称准至0.0001g溶于50 ml