[医学]第十二讲 RNA干扰111226-2.ppt

第十二讲 RNA干扰 基础医学院生物化学与分子生物学教研室 Song fangzhou 2011.12 Contents RNA干扰RNA interference (RNAi，1.RNA抑制，2.RNA干涉， 3.RNA干扰，4.RNA沉默)Knock Down 生命科学的中心法则 目前应用的基因干扰技术 DNA水平的基因干扰技术 基因敲除技术 寡核苷酸与双链DNA 杂交 采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子 目前应用的基因干扰技术 mRNA水平的基因干扰技术 用反义RNA 技术阻遏翻译过程, 破坏内源性mRNA 设计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白质, 使mRNA 不稳定 双链RNA 干扰技术（RNAi） RNAi的发现和发展历程 1984年,Jonathan 研究小鼠 L 细胞时发现反义mRNA 会干扰同源基因的表达，机制不清 1990年 Jorgensen等 矮牵牛颜色加深实验 “共抑制(co-suppresion)” 1990, Jorgensen et al, 材料：矮牵牛花 ( petunias) 目的：得到紫色更深的花 方法：构建强启动子色素基因（苯基苯乙 烯酮合酶）表达载体，导入牵牛花 结果：杂色（花变得更白）。 分析：所转基因（外源）和同源的内源基因的表达都被抑制。这个现象称之为共抑制（co-suppression） 1995,康乃尔大学Guo Su et al 材料：秀丽新小杆线虫（C. elegans） 目的：消除线虫第一次分裂的不对称性 方法： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 1998，Fire et al 材料：线虫 目的：同上 方法： 注射经过纯化的由T4和T7 RNA聚合酶体外转录得到的ss-RNA; 注射经过纯化后的ds-RNA 结果： ss-RNA 引起微弱的抑制作用； ds-RNA 比前者高两个数量级的抑制效果。 分析： Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。 2006年诺贝尔生理学或医学奖获得者 1999年 Tuschl等 报道在哺乳动物中也存在RNAi 2001 年 Berstein 等 提出只有22 核苷酸dsRNA才有特异性的阻断效应，并发现体内分解dsRNA 为siRNAs (short/small interfering RNA) 的 DICER 酶 1999 年, Hamilton 等在植物基因沉默的研究中首次发现,21～25nt 的dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重要,而在转基因正确表达的植株中则未出现。 涡虫(Ｐｌａｎａｒｉａｎ) Ｓａｎｃｈｅｚ＿ＡｌｖａｒａｄｏＡ，ＮｅｗｍａｒｋＰＡ，1999．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，96：504～5054 水螅(ｈｙｄｒａ) ＬｏｈｍａｎｎＪＵ，ＥｎｄｌＩ，ＢｏｓｃｈＴＣ，1999．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，214：211～214 锥虫(ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ) ＮｇｏＨ，ＴｓｃｈｕｄｉＣ，ＧｕｌｌＫ，ＵｌｌｕＥ，1998．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，95：14687～14692、 真菌(ｆｕｎｇｉ）（neurospora crassa) ＣｏｇｏｎｉＧ，ＭａｃｉｎｏＧ，1999．Ｎａｔｕｒｅ，339：166～169 果蝇(Drosophila)中发现ＲＮＡi Berstein E et al Nature 2001,409(6818):363-366 拟南芥中发现ＲＮＡi Wassnengger M et al plant Mol Biol 1998, 37(2): 349-362 小鼠中发现ＲＮＡi Wianny F et al Nat cell Biol 2000 ,2 (2):70-75 2002 年 Novina 等 用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑 2004年 Morris 等 用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制 Science 2004(August 27)；305：1289-1292 当dsRNA导入细胞后，被一种特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可识别目的mRNA。与相关蛋白结合，形成dsRNA-酶的复合物。 识别之后，目