流感病毒实验室检测PPT.ppt

鸡胚分离流程（2） ◆用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚 ◆将针头弃于合适的生物安全装置中 ◆用消毒过的医用胶布封口 ◆ 33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去 鸡胚分离流程（3） ■收获尿囊液和羊水 ■鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4小时 ■标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致 ■用70%～75％酒精消毒鸡胚顶部 ■用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并 鸡胚病毒鉴定 经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去 鸡胚收获 HA试验 病毒鉴定 红细胞凝集 红细胞凝集抑制试验 病毒鉴定流程 红细胞凝集试验 4个凝集单位配制“回滴” 红细胞凝集抑制试验 判定流感病毒型别 红细胞凝集试验（HA） MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度 原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现 红细胞 鸡 火鸡 豚鼠 人O型血红细胞 马 适用范围 流感和禽流感病毒 流感和禽流感病毒 流感病毒 流感病毒 禽流感病毒 终浓度（％） 0.5（1%） 0.5（1%） 0.75（1.5%） /0.5（1%） 0.75（1.5%） /0.5（1%） 0.5（1%） 孔底部形状 U或V型 U或V型 U型 U型 U型 孵育时间 30min 30min 45min 45min 60min 细胞对照 细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状 细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状 细胞沉积成环状 细胞沉积成环状 细胞沉积成环状 A H B C D E F G 100ul病毒液 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液 50ulPBS 稀释病毒 加入配制好的红细胞悬液 充分混匀，置室温孵育30-60分钟 观察记录结果 病毒 原液 1：2 1：128 HA： 32 HA＞128 HA： 4 红细胞凝集试验（HA） HA滴度≥8，进行红细胞凝集抑制（HI）试验；HA滴度8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴度≥8后，再进行HI测定 若传1～2代后，HA滴度仍8者，可应用核酸检测方法进行鉴定 红细胞凝集抑制（HI）试验 HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标准参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI）试验，确定病毒的型别和亚型，进行HI试验时，需同时进行4种标准抗原对照。 红细胞凝集抑制试验步骤 4个凝集单位的配制和检测 稀释血清 加入25ul 4个血凝单位抗原，室温孵育15-30分钟 每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。室温孵育30-60分钟 观察记录结果 4个凝集单位的配制和检测 4个凝集单位的配制 读取红细胞凝集试验的结果 计算所须的4个凝集单位的病毒用量 用50ul检测4个凝集单位时，用凝集效价除以8，所得商即为4个单位的稀释度 用红细胞凝集试验“回滴”，复核4个凝集单位 用50ul，前4孔完全凝集 。此时的抗原即为4个凝集单位 红细胞凝集抑制试验稀释血清 1 2 7 6 5 3 4 9 8 10 H1 血清 50ul H3 血清 50ul 50ul PBS B 血清 50ul 25ul PBS 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul B 血清 50ul H3 血清 50ul H1 血清 50ul 流感病毒实验室检测技术及盲样考核结果分析 湖南省疾病预防控制中心 微生物检验科 黄一伟 2013-12-27 流感监测目的 （一）监测流感活动水平和流行动态； （二）及时发现流感病毒变异并作出预警； （三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。 流感监测内容 （一）流感样病例监测 （二）流感样病例暴发疫情监测 流感样病例监测标本采集 采集对象： 流感样病例 发热