实验19、基因突变RAPD分析.pptVIP

湖南文理学院生命科学系: 熊 * 实验19、基因突变RAPD分析 (9课时) 1.掌握基因组DNA提取、纯化和鉴定技术，能从基因诱发突变材料中提取、分离DNA,进行PCR扩增检测鉴定。 2.掌握基因突变RAPD鉴定技术，获得诱发突变材料与未诱变对照RAPD指纹图谱，比较诱发突变变异RAPD指纹特征。 一、实验目的 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术，是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异目的DNA序列拷贝。在分子克隆、基因检测、基因诊断等方面广泛应用。 三、实验原理 1.多聚酶链式反应 三、实验原理 2.PCR技术三步骤 ①变性：94℃左右模板DNA变性形成单链； ②退火：55℃左右随机引物与同源序列结合； ③延伸：70-72℃Taq聚合酶催化４种dNTP形成双链. 一次循环后合成DNA为模板,循环30次,DNA增106-7倍。 建立在PCR基础对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。 基因组DNA为模板, 随机多态核苷酸序列为引物, 在Taq 酶作用下,PCR 扩增。 经电泳分离.染色.检测其多态性。 三、实验原理 3.RAPD技术 200~800 12 GGGCCACTCA S201 300~800 6 TCACGTCCAC S88 100~800 5 AGCGTGTCTG S84 500~900 5 GGACCCAACC S42 100~1000 10 CCACAGCAGT S18 200~1000 7 GGACTGCAGA S158 200~600 7 GGCTCATGTG S98 200~900 7 GTCGCCGTCA S43 300~800 6 AGGGGTCTTG S25 200~1000 14 GTTTCGCTCC S1 100~1000 12 CTGCTGGGAC S10 200~900 6 GGTGACGCAG S7 500~1000 5 CAGGCCCTTC S21 长度(bp) 带数 序列(5′-3′) 引物 四、实验试剂 １０×buffer: 500mM KCl 100mM Tris-HCl(pH9) 0.1% 明胶 1% TritonX-100 MgCl2 2.5mM ４×dNTP: 1mM 引物：TGGCCGAGCTG 5.0uM 模板： 20ng/μl Taq酶： 5u/μl PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统 五、实验步骤 1.基因组DNA 制备 ①研磨：100mg材料液氮研磨,加CTAB.巯基乙醇冰浴;离心;弃上清。 ②抽提：3×CTAB缓冲液，65℃水浴30min；加入等体积饱和酚:氯仿:异戊醇=25:24:1；加1/2体积5M Nacl、异丙醇，室温放置1h; 10000r/min,10min;弃上清。 ③纯化：两倍体积无水乙醇沉淀DNA，干后加适量TE溶解4℃保存 2.　RAPD 扩增 94℃预变性7min 循环 94℃变性 60s 37℃复性 90s 72℃延伸 90s 40个循环后72℃延伸 7min 反应物 体积 10×buffer 2.5μl 4×dNTP(1mM) 2.5μl MgCl2 (25mM) 2.5μl 无菌水 10.5μl Taq酶 (1U/ul) 1μl 引物 2μl 模板ＤＮＡ (20ng) 4μl 总体积 25μl PCR反应体系 反应程序 五、实验步骤 3.琼脂糖凝胶电泳检测 20μl反应液 4μl buffer 1.5%琼脂糖凝胶 120伏电泳2小时 凝胶成像系统观察，并记录结果 五、实验步骤 4.分光光度计检测 五、实验步骤 15μl样品稀释至3ml 测定A260和A280吸光值 DNA浓度计算 A260nm：260nm处吸光收读数 L： 比色池厚度,为1 cm 0.02： 1μgDNA钠盐吸光值 *