第5章 酶学分析.ppt

第五章　;酶（enzyme）的本质： ;主要内容：;掌握酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。 熟悉酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。 了解同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的校准、工具酶的应用。;第一节 酶活性测定的基本知识;简介内容：;1．惯用单位： ;;（二）酶活性浓度;三、酶促反应进程 ;（一）延滞期（lag phase、延迟期 ）;（二）线性期;（三）非线性期（偏离线性期、平坦期 ）;四、酶促反应动力学;（一）酶促反应;（二）Km的含义与意义;（三）Vmax的含义;（四）Km和Vmax的测定;利用此图还可用于判断可逆性抑制反应的性质： ;第二节 酶活性单位的计算与校准;一、酶活性单位的计算;注释：式中U：酶活性单位数，m0：规定的产物生成量或底物消耗量，V0：规定的样本体积，t0：???定的反应时间，mu：实际产物生成量或底物消耗量，Vu：实际样本体积，tu：实际反应时间 ;（二）采用酶活性惯用单位的计算公式;惯用单位的计算公式：;1、测定产物生成类的计算公式 ;校准曲线法和公式：; 测定管：血清0.1ml加底物液等后于37℃水浴15min，再加显色液显色。同时，设立除先不加血清、其它步骤相同的空白管（在反应最后加血清），510nm处以空白管调零测出△Au。 校准管：以校准曲线中第2管为例。取0.05mg/ml的酚校准液0.4ml，加显色液等至总体积与测定管相等，用蒸馏水替代酚校准液、其它步骤相同的空白管调零，510nm处测出△Ac。 【计算】 由式5.2有： ;2．测定底物消耗类的计算公式 ;例：碘色法测定血清淀粉酶（AMS） ;（三）采用酶活性国际单位的计算公式; 在连续监测法测定酶活性时，tu为酶促反应曲线线性期内时间变化值（亦可表示为△tu ），△Au为线性期内测定管吸光度变化值 ;另外一种推导方式 ; 0.2ml样本中加入底物液于37℃15min，终止反应后总体积为 5.2ml。405nm处以空白管调零，1cm比色杯中测△Au。已知对硝 基酚在该条件下的ε为18 380 L·mol-1·cm-1。 ;2．用毫摩尔吸光系数（mε）、摩尔吸光系数（ε） 表示的国际单位计算公式 ; 3．计算因数与测定产物生成类、底物消耗类的吸光度变化 方向的关系 ;4．国际单位间无可比性 国际单位数相同的不同酶并不表示酶含量相同，因为其具体反应条件不尽相同，酶的激活与抑制状态也不相同，故国际单位之间无可比性。 ;二、酶活性单位的校准(了解);第三节 酶活性的测定;一、按照反应时间分类的酶活性测定方法;（二）连续监测法;;特点： 与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应； 连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物）或产物量的变化，因此，在测定原理上，可以选择紫外吸收法或生色原显色法； 要求能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要求 ； 测定结果常较定时法高，因为在酶促反应初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小，所以反应后期的吸光度等检测信号就比定时法要高且真实，因而测定结果也较定时法准确。 ;（一）直接法;1．测定NAD（P）H的方法 原理：监测340nm吸光度的变化可以反映NAD（P）H量的变化，其变化与待测酶的含量正相关。 对象：以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类。例如LD、G-6-PD、GLDH等 。;人工合成的色素原底物;（二）间接法 ;1．酶偶联法 ;　表5-4 一些酶偶联法的待测酶与工具酶 ;2．化学法 ;三、工具酶的应用 四、酶活性测定的影响因素