jak2stat3信号通路在依达拉奉减轻大鼠小胶质细胞缺血再灌注损伤中的作用.docVIP

JAK2STAT3信号通路在依达拉奉减轻大鼠小胶质细胞缺血再灌注损伤中的作用 　　[摘要] 目的 评价Janus激酶2/信号转导子和转录激活子3（JAK2/STAT3）信号通路在依达拉奉抑制大鼠小胶质细胞缺血再灌注损伤后脑损伤中的作用。 方法 体外培养SD乳鼠小胶质细胞，采用随机数字表法分为常规培养组（C组）、糖氧剥夺组（OGD组）、依达拉奉组（EDA组）。OGD组小胶质细胞糖氧剥夺6 h，再灌注12 h建立缺血再灌注损伤模型；EDA组细胞糖氧剥夺后加入含EDA（浓度50 μmol/L）的正常培养基后处理12 h。采用CCK8法检测细胞存活率的变化；Western blot法检测JAK2蛋白磷酸化（p-JAK2）、STAT3蛋白磷酸化（p-STAT3）变化；ELISA法检测IL-1β和IL-6的变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率。 结果 与C组比较，OGD组细胞存活率降低，p-JIK2和p-STAT3的表达上调，细胞上清液中IL-1β和IL-6浓度增加，细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P 　　[关键词] 依达拉奉；小胶质细胞；STAT3转录因子；脑损伤 　　[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）11（a）-0016-04 　　依达拉奉是氧自由基清除剂之一，可以减轻脑缺血再灌注的损伤，改善临床预后[1-4]。蛋白质酪氨酸激酶2/信号转导与转录激活因子3（JAK2/STAT3）信号通路是通过可溶性信号分子激活，参与细胞免疫调节、细胞凋亡等生物学过程[5]。动物整体水平研究表明，依达拉奉通过可以调节JAK2/STAT3信号通路减轻脑缺血再灌注损伤后半暗带区炎性反应，减少神经细胞凋亡[6]。而小胶质细胞是中枢神经系统重要的免疫调节细胞，对中枢神经系统炎性反应起着重要作用。本研究拟观察依达拉奉是否通过调节JAK2/STAT3信号通路抑制小胶质细胞缺血再灌注损伤后的炎性反应和细胞凋亡。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料与主要试剂 　　实验动物是出生24 h内SD乳鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物合格证号：2007000582928。DMEM培养基购自Gibco公司，依达拉奉由南京先声东元制药有限公司生产（生产批号，CCK-8试剂盒购自Sigma公司，Anti-CD11b/c购自Abcam公司，抗体p-JAK2购自Santa Cruz公司，抗体p-STAT3购自Cell Signaling公司，ELISA试剂盒购自Sigma公司。本研究动物试验经实验动物伦理委员会批准。 　　1.2 方法 　　参照文献[7]的方法培养原代小胶质细胞，主要步骤如下：在严格无菌的条件下取新生乳鼠，断头，取脑，剪碎脑组织，用胰酶消化，离心后制成细胞悬液，接种入细胞培养瓶，置于恒温培养箱培养，细胞培养14 d左右，倒掉培养液，用胰酶消化，将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入离心管，离心后接种于细胞培养板继?m培养，10 min后弃掉不贴壁细胞，继续培养。采用温和消化法[8]分离纯化小胶质细胞，用流式细胞仪检测小胶质细胞纯度。 　　1.3 实验分组 　　取纯化的小胶质细接种于培养板，采用随机数字表法将其分为三组：正常对照组（C组）、糖氧剥夺组（OGD组）和依达拉奉组（EDA组）。C组正常培养12 h。OGD组换成不含糖的DMEM培养基并置于5%CO2、1%O2、94%N2培养箱孵育6 h[9]，糖氧剥夺后换成正常培养基并置于正常环境下细胞培养箱继续培养12 h用于实验。EDA组在糖氧剥夺后将培养基换成含依达拉奉（50 μmol/L）的正常培养基继续培养12 h用于实验。 　　1.4 指标观察 　　1.4.1 细胞存活率检测 采用CCK8法对各组细胞进行活力检测，用多功能酶标仪测定各孔在450 nm处吸光度，计算细胞存活率（%）=（加药组吸光值-空白对照组吸光值）/（不加药组吸光值-空白对照组）×100%。 　　1.4.2 小胶质细胞p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白水平检测 采用蛋白质免疫印迹分析（Western blot）。参照细胞质蛋白提取方法，将各组细胞离心收集后，经裂解高速离心，吸取上清液并加入上样缓存液混匀后，煮沸8 min，按照试剂盒操作要求，行聚丙酰胺凝胶电泳转印到硝酸纤维素膜上，用脱脂奶粉室温下封闭1 h，然后加入一抗p-JAK2和p-STAT3，4℃孵育过夜，然后加入二抗孵育，使用增强化学发光法显色，采用凝胶分析软件进行分析，以目的蛋白条光密度值与内参条带光密度值的比值反应目的蛋白表达水平。 　　1.4.3 IL-1β和IL-6水平检测 采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定小胶质细胞培养上清液IL-1β和IL-6水平。实验操按照说