毒理学新技术.pptVIP

体外试验与生物新技术在毒理学中的应用 分类 依据体外试验在决策过程中所起的作用 筛选试验。它仅提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。 附加试验。它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有它是不够充分的。 替代试验。它是在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物试验，以提供更多的信息。 基本原理 体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。 体外毒性试验系统的优点 能控制环境因素 可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响 每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等 试验间的误差较少 可同时和／或反复多次取样 可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培养等 较为快速和经济 需要较小量的受试化合物 产生较小量的有毒废物 可以利用人体细胞 减少整体动物的使用 体外试验系统 脏器灌流 肝脏灌流 肠灌流 膈肌-膈神经标本 脏器切片 原代细胞培养 肝细胞原代培养 巨噬细胞 淋巴细胞 脑细胞 心肌细胞 细胞培养 组织匀浆 亚细胞组分 细胞膜 微粒体 线粒体 酶 哺乳动物细胞制备和培养 体外系统分离的细胞包括悬浮液中的新鲜游离细胞、原代培养细胞、细胞株、细胞系及复合培养的细胞 在毒理学中以哺乳动物细胞作为实验动物的替代系统的原因 来自公众要求减少实验中使用动物数量的压力 整体动物实验可显著地减少常规整体动物实验所需的高额费用 人们越来越不满意实验动物与人体结果之间相关性的缺乏。 体外系统——细胞在毒理学中应用的优、缺点 优点 改善效率，减少费用 使用实验动物较少 仅需少量的受试物 较大程度控制细胞族的性状 直接控制胞外基质、化学物浓度及接触时间 排除可能的混淆因素如激素；神经系统或免疫系统的影响 可从同一实验体系重复取样 缺点 缺少整个器官的形态学观察 选择性丧失整体器官特异性功能，如毒性代谢酶的丧失 缺乏可能的调节影响因素如激素，神经系统或免疫系统， 一般为静态系统，将导致营养物质的逐渐减少和代谢终产物的逐渐累积。 多为短期试验，对亚慢性或慢性毒性的评估价值不大 毒理学研究中常用细胞 各种物种的成纤维细胞 淋巴母细胞 腹水瘤细胞 淋巴细胞 角质细胞 肝 细 胞 肝癌细胞 肾脏髓质和皮质细胞 肺的各种类型细胞 培养的背根胶质细胞 培养的睾丸细胞 膀胱细胞 心脏细胞 脊髓微血管细胞 脂肪细胞 细胞实验方法 建立正在迅速生长的细胞株，用以观察受试物对整体细胞的一般毒作用和正在分裂组织的毒作用 利用已高度分化的细胞，无论是原代培养或是特定的细胞株，研究受试物对已分化成熟的细胞或其功能的特殊毒作用； 超净工作台 培养瓶 细胞计数 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 血细胞计数器：手工计数细胞 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3．贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力 检测的细胞： 组织分离的细胞 复苏后的细胞 1．台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色； 方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟； 3、镜检计细胞活力。 死细胞深兰色，活细胞呈无色透明状。 2．四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解蓝紫色，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。酶标仪测定OD值。 细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。 冻存和复苏的原则：慢冻快融慢冻程序： 将冷冻管放入纱布袋内，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐