脂质膜蛋白和脂多糖诱导SPLUNC1基因表达差异.docVIP

精品论文 参考文献 脂质膜蛋白和脂多糖诱导SPLUNC1基因表达差异 1.湖南省儿童医院新生儿科 中国湖南长沙 410007；2.湖南省人民医院儿科 中国湖南长沙 410007 【摘 要】目的 比较不同浓度肺炎支原体脂质相关膜蛋白（MP-LAMPs）和脂多糖（LPS）诱导人支气管上皮细胞（HBECs）短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）基因表达的差异。探讨SPLUNC1在呼吸道不同病原菌感染中的作用。方法 ①MTT法检测不同浓度的LPS和MP-LAMPs对HBECs细胞增殖的影响，寻找MP-LAMPs与LPS对HBECs细胞增殖影响相似的浓度。②不同浓度的MP-LAMPs和LPS诱导人支气管上皮细胞SPLUNC1基因表达差异是通过实时荧光定量FQ-PCR检测。结果 MP-LAMPs刺激HBECs后SPLUNC1基因表达在24h内先升高后下降，而LPS诱导的在同时间内SPLUNC 1基因表达趋势呈持续升高。结论 24h内MP-LAMPs和LPS诱导HBECs SPLUNC1基因表达变化趋势不同。 【关键词】人支气管上皮细胞；脂多糖；肺炎支原体；脂质相关膜蛋白：SPLUNC1 粘膜分泌蛋白PLUNC家族是呼吸道的先天免疫防御物质，在保护呼吸道正常的生理功能中起重要作用，而短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）是其家族中高表达于呼吸道、参与先天免疫应答的蛋白分子。目前对SPLUNC1作用机制和功能的研究还没有一致的定论，但大多认为它参与了呼吸道抵御病原菌的先天免疫应答，且很有可能拥有抑菌、杀菌的作用。 目前临床上发现，在感染肺炎支原体后，不仅会出现气道高反应性导致喘息，还可诱发支气管哮喘的急性发作，但这种现象仅发生在少数细菌感染的患者。有研究报道SPLUNC1可减轻炎症反应，并发现在气道过敏性反应中SPLUNC1蛋白水平显著降低[1]。那么SPLUNC1基因表达在不同感染后是否存在差异，例如MP和革兰氏阴性细菌感染？ 肺炎支原体粘附和侵入宿主细胞主要是由肺炎支原体脂质相关膜蛋白（MP-LAMPs）介导的，可引起宿主细胞损伤和死亡，而脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌死亡后释放的毒力产物，本研究利用MP-LAMPs和LPS刺激HBECs，比较SPLUNC1基因表达的差异，探讨SPLUNC1在呼吸道不同病原菌感染中的作用，为以后人工调控其分泌、防治呼吸道感染进行前期研究，并试图揭示MP感染后反复喘息的可能机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种与细胞 南华大学病原微生物研究所提供肺炎支原体标准株；LPS购于sigma公司；湘雅医学院细胞中心购买人支气管上皮细胞。 1.1.2 主要试剂及仪器 Mycoplasma Broth基础培养基购自美国BD公司：OMEGA公司购买E.Z.N.A.Total RNA Kit I；RPMll640购自Gibco公司；TaKaRa公司购买PrimeScriptRT reagent Kit Perfect Real Time。 1.2 方法 1.2.1 肺炎支原体培养及其脂质相关膜蛋白（LAMPs）的提取参照文献进行[2];蛋白浓度通过BCA蛋白法测定。 1.2.2 HBECs的培养 用10% FCS的RPMI-1640培养基在5% CO2、37℃的恒温细胞培养箱中培养HBECs。 1.2.3 通过MTT法检测 MP-LAMPs和LPS对细胞增殖的影响 将生长良好的HBECs置于5% CO2培养箱中培养24小时后弃原培养液，再进行分组处理。对照组、MP-LAMPs组（浓度分别为0.1mu;g/mL、0.5mu;g/mL、1.0mu;g/mL、5.0mu;g/mL）、LPS组（浓度分别为0.01mu;g/mL、0.1mu;g/mL、1.0mu;g/mL、10mu;g/mL），各浓度设4个复孔。在培养终止前每孔加入20mu;L MTT溶液再继续培养4h，然后弃去上清加入150mu;L二甲基亚砜，放到摇床上待结晶完全溶解，通过酶标仪570nm测定吸光度值（A值）。相对生长指数（GI）=（处理组A/对照组A）times;100%，GIgt;100%为刺激生长，GIlt;100%为抑制生长。 1.2.4 实验分组 将HBECs随机分成3组：MP-LAMPs组、LPS组和对照组。MP-LAMPs组：浓度分别为0.1、0.5、1.0及5.0 mu;g/mL；LPS组：浓度分别为0.