胆管电凝损伤早期修复过程中α-SMA和PCNA的表达.docVIP

精品论文 参考文献 胆管电凝损伤早期修复过程中α-SMA和PCNA的表达 孙礼侠1 方 圆2 顾鑫瑾2 陈 鹏2 钱 言2 1.安徽省芜湖市第一人民医院 2.安徽省芜湖市皖南医学院 安徽 芜湖 241000） 【摘要】目的 通过检测alpha;-SMA和PCNA在胆管电凝损伤早期修复过程中的表达，探索BBS的形成机制。方法 将40只兔子随机均分为3d组，5d组，7d组，14d组和假手术组，即A、B、C、D、E五组。高频电刀20W功率电凝1s，取各时间点胆管做alpha;-SMA和PCNA的免疫组化染色并进行观察和分析。结果 单因素分别分析alpha;-SMA和PCNA各手术组与假手术组的胆管表达强度均有统计学意义（P＜0.05）。且alpha;-SMA和PCNA的表达强度随着损伤时间的延长，表达强度也在不断增强。结论 alpha;-SMA和PCNA的表达与胆管损伤后修复有关，alpha;-SMA和PCNA的过度表达会导致BBS的形成。 【关键词】胆管损伤；alpha;-平滑肌肌动蛋白；增殖细胞核抗原；胆管良性狭窄 胆管电凝损伤后容易引起胆管良性狭窄（BBS）。BBS在临床上比较常见，主要表现为胆管腔狭窄和瘢痕性挛缩，其处理一直是胆道外科的难题。近年来胆管瘢痕研究显示alpha;-滑肌肌动蛋白（alpha;-smooth muscle actin，alpha;-SMA），增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）等细胞因子在瘢痕的挛缩中起了重要作用。本实验通过建立兔胆管电凝损伤早期修复模型，术后动态观察alpha;-SMA和PCNA在修复过程中的表达，探讨其在BBS中的意义。 1.材料和方法 1.1实验动物和器材 健康普通的新西兰白兔40只，雌雄不限，体重2.45~3.35kg，由南京青龙山动物养殖场提供。用随机数字表法将40只新西兰兔子平均分配成5组，其中4组为手术组，编号分别为A、B、C、D，另一组为假手术组，编号为E，每组各8只。实验前用兔颗粒饲料适应性饲养7天，整个实验过程严格遵照有关动物管理规定处理。医用电刀为POWER-420型高频手术器，由常州市延陵电子设备有限公司制造。医用电刀时间控制装置，由芜湖市第一人民医院自行研发，已获国家专利（专利号：ZL201020268592.2）。在电刀笔的金属刃上用铁丝缠上一根大头针，制成实验电刀笔，其针帽向前突出，作为与胆管壁的接触点，直径约为2.0mm。 1.2实验方法 手术组术前禁食8小时、禁水4小时，术前用10%氨基甲酸乙酯按1g∕kg剂量从耳缘静脉处将白兔麻醉，然后剪去背部和腹部的毛，背部用水打湿贴在高频手术装置的铅板上，固定后消毒铺巾。经上腹正中切口逐层进腹后分离出胆管，暴露出胆囊管入肝总管处，电凝点为胆囊管与胆总管交叉处下约0.5cm的部位，将实验电刀笔上的大头针帽充分接触到胆总管管壁上。用混切3模式对3d、5d、7d和14d取材组的新西兰白兔分别用相同的功率20W精确电凝1S[1]，对胆总管造成定量的电凝损伤。术后探查无胆漏后关腹，连续3d每天肌注庆大霉素4万预防感染。假手术组不做电凝。 1.3标本的采集和免疫组织化学 分别在术后3、5、7和14d，采用耳缘静脉空气栓塞法处死实验组的白兔。剪取胆管电凝损伤部位上下0.5cm，用生理盐水冲洗后放入10%的福尔马林溶液中固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋后制成蜡块，沿胆总管横切面切片，制成5mu;m的连续切片，分别行免疫组化染色和HE染色。免疫组化染色：采用SABC法，第一抗体兔alpha;-SMA和兔PCNA多克隆抗体、第二抗体抗alpha;-SMA多抗和抗PCNA多抗为生物素标记的鼠抗兔IgG及免疫组织化学SABC试剂盒均购于武汉博士德公司。染色步骤按SABC试剂盒说明进行，DAB显色剂显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，观察。 1.4结果的判定标准 alpha;-SMA阳性细胞的评定标准：细胞浆染成棕黄色为阳性细胞。取染色良好（阳性细胞清晰，背景染色很低）的组织切片，在高倍镜（times;400）下随机选取5个视野，用软件计算被染成棕黄色区域的累积光密度，再测量总的视野面积，累积光密度／视野面积可得平均光密度，取平均值。PCNA阳性细胞的评定标准：细胞核染成棕黄色为阳性细胞。取染色良好的组织切片，随机取5个高倍视野（times;400）观察，用软件计算每个视野阳性细胞数和全部细胞数，阳性细胞数／全部细胞数可得阳性细胞率，取平均值。 1.5 统计学处理