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利用冷冻扫描电子显微镜对植物体进行X射线显微分析 常规扫描电镜处理 2%戊二醛溶液4℃固定24小时，磷酸缓冲液冲洗 1%锇酸溶液4℃固定4小时，磷酸缓冲液冲洗 不同浓度乙醇梯度脱水 乙酸异戊酯置换，CO2临界点干燥 真空镀膜。 或ESEM 缺点：丢失电解质无机元素及形变 * * 扬州大学测试中心 周卫东 2008.03.30 引言 在植物科学中，现代显微技术在提供超微结构和分析资料的方向上取得了很大的进展。能谱分析是一个强有力的技术，使得能对细胞和亚细胞水平生理需要的许多元素进行定性和定量测量。最显著的进步已经发展到利用冷冻扫描电子显微镜的能谱分析技术研究细胞植物组织。冷冻技术对保留组织电解质无机元素原有的分布进行充分的微量分析是足够快的。这种做法可能为各类与植物生理学相关的定位，环境污染，以及植物-微生物间相互作用提供广泛的应用。 制样前的准备 1. SEM样品支撑杆。 2. 双面胶 3.冷冻胶 4. 冷冻管 5. 处理冷冻了的冷冻管的大镊子 5.尖头小镊子 7.刀片或解剖刀 8.主要冷冻剂（液氮） 9.次要冷冻剂（如丙烷） 10. 高纯氩气 11.包覆金属 12.液氮的冷冻罐 13.1升液氮的杜瓦瓶用于临时储存和转移样品 方法 1.生物样品的冷冻固定 冷冻固定就是指使含水的样品在其样品成分损失最小的情况下使其通过速冷固态化。冷冻固定需要迅速制冷到130K以防止有害冰晶的生长。在低于130K时，水分子的移动性非常慢以致于不能形成冰晶。 a. 选择一新鲜的叶片、根等，用解剖刀把其切成小片，随后用滤纸把去除黏附在剥离样品的水。 b.把样品放在样品台上。样品用冷冻胶保持冷冻断裂垂直于短截线或用双面胶横向展开，用于分析断裂面。 c.用镊子，在初级或次极的冷冻剂中冷冻处理粘好的样品至少5秒。然后迅速转移标本到液氮和放开镊子。 d.储存冷冻标本在液氮罐中直到需要观察。 2.扫描电镜-能谱分析的样品冷冻制备 现代低温扫描电镜设备中有一个高真空的冷冻制备室直接连在扫描电镜上。包含一个由液氮制冷的冷冻台，标本可保持在可控制的温度。冷冻制样室与扫描电镜分离。样本的转换是由低温制备室和扫描电镜之间开放阀控制。在制样室制样 (包括：冷冻、断裂、干燥、导电处理)后，被转到扫描电镜温度控制的冷冻台上，这样它就可以在非常低的温度下测试(150K)。 用加速电压在12和18千伏之间的扫描电镜的二次电子模式观察冷冻植物样品（表面或断裂面）。 3. 能谱分析的冷冻扫描电镜操作条件 从样品中得到的X—射线数量依赖于电子显微镜的分析参数设置和检测样品的探头卖类型。 选择加速电压：通常需要电压在12到18千伏。以得到一个好的空间分辨率。 检测样品几何构型必须优化：这包括移动探头到样品附近以使X射线采集立体角最大，调整样品的倾斜角，并调整样品的高度。 具体步骤 挪威云杉根菌根的冷冻断裂扫描电镜图像。这种树的幼苗在普通营养液中生长，补充铝为氯化铝（10ppm）。根处的元素已经用能谱仪检测出来。记录了点分析得到的三个光谱。（A）根皮层细胞的细胞壁（B）真菌旁细胞壁。（C）根皮层细胞的液泡。能谱显示出除检测元素的特征峰外在峰下有强烈的背景。 Thlaspi caerulescens 叶片的冷冻断裂X—射线图象。扫描电镜显微图像和组织断面中硫、钙、锌的相应元素图谱。Thlaspi caerulescens 是一种重金属积累植物。锌的积累主要出现在表皮细胞。钙主要沉积在表皮（E）和叶肉（M）细胞中，但分布不均匀。在叶脉处的硫比在表皮和叶肉细胞处的多。