根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母的遗传转化研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四挺奎固发酵工程学术讨论套论文采 根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母的遗传转化 张君胜，饶志明，沈徽，方慧英，诸葛健 (江南大学工业微生物中心和工业生物技术教育部重点实验宣，扛苏无锝214038) 3300一Zeocin， 转化到广泛的宿主细胞并能整合到宿主染色体中．研究通过构建质粒pCAM 将其电击转什根癌农杆菌。通过将古有目的质粒pCAM3300一Zeocin的根癌农杆菌和产甘 油假丝酵母(Candida pCAM3300-Zeoci．对产甘油假丝酵母的转化。在研究中根据根癌农杆菌的生长特性，对转 化条件进行了优化，在共培养时闻为24h，细胞比例为1，5001，00时最高转化率达到2 十转化子／lO‘个酵母细胞。初步建立了根癌农杆菌夼导转化产甘油假丝酵母的转化方法为 进一步研究产甘油假丝酵母打下基础。 关键词：产甘油假丝酵母I转化，根癌农杆菌 用原生质体法将质粒成功转入酿酒酵母。目前广泛采用的酵母转化方法主要有原生质 体转化法、醋酸锂转化法、电击转化法等，这些方法在酵母的遗传转化研究上已取得了巨 大的成功。但是它们在转化生产菌株产甘油假丝酵母时遇到了很大的困难。根癌农杆 菌介导的遗传转化以其操作简单、转化率高、转基因低拷贝、易于得到稳定的转化子等特 点．广泛的应用于植物的基因转化。Bundock口3等1995年首次成功实现了根癌农杆菌介 导酿酒酵母的遗传转化。 耐高渗产甘油假丝酵母(Candida 物研究中心的科技工作者经过三十年的潜心研究得到的优良菌株。产甘油假丝酵母具 有甘油产率高、耐高渗、生长快、发酵原料简单等优点，是一类具有很高的潜在应用价值 的酵母Ⅲ。采用基因工程手段构建重组菌是进一步改进产甘油假丝酵母性能的重要途 径，实现这一目标首先要获得有效的载体和转化方法，在此基础上才有可能对产甘油假 丝酵母代谢途径进行有目的的改造，以达到提高甘油产量和改善工艺的目的。因此．建 立产甘油假丝酵母的遗传转化体系具有重要意义。 在本研究室的前期工作中，曾尝试用常用的酵母转化方法转化产甘油假丝酵母，但 均未获得成功。在作者对根癌农杆菌转化酿酒酵母研究的基础上D]，受到根癌农杆菌介 导转化酵母研究和根癌农杆菌介导转化在丝状真菌转化中广泛应用的启发，本研究了采 用根癌农杆菌介导的方法转化产甘油假丝酵母的可行性。并针对产甘油假丝酵母生长 快的特点结合本研究的转化方法对转化条件进行了适当的优化。 1材料与方法 1．1菌株和质粒 张君胜等：根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母的遗传转化 耐高渗产甘油假丝酵母、根癌农杆菌LBA4404含利福霉素及链霉袭抗性为本研究 3300由中国水稻研究所馈赠。Zeocin抗性基因有本研究室工作人 室保藏。质粒pCAM 员从购自Invitrogen公司的质粒pPICZB上得到。pEGM-T—Easy 司产品。 1．2工具酶和试剂 实验中的各种酶、氨基酸营养因子和抗生素均购自上海华美生物工程公司。乙酰丁 1．3培养基 LB培养基(g／L)：蛋白胨10．00、酵母膏5．00、氯化钠10．00； YPD培养基(g／L)：蛋白胨20．00、酵母膏10．oo、葡萄糖20．00； 6．0 SM培养基(选择培养基)(g／L)：酵母氮基6．70、葡萄糖20．00；pH MM培养基(基本培养基)、IM培养基(诱导培养基)见文献[6]、[7]。‘ I．4根癌农杆菌的转化 将质粒pCAM 上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证。根癌农杆菌质粒提取方法见参考文献[8]。 1．5根癌农杆菌Ti质粒转化产甘油假丝酵母[” 接种含有质粒pCAM h， 50／-g／mL，利富霉素50,ug／mL，链霉素30t．Eg／mL)中，30C，200r／min摇床培养36 离心收集菌体，用等体积的IM培养基重悬，培养6h；接种产甘油假丝酵母于YP